Inmunoconjugados anti integrina, métodos para su producción y su uso.

Conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende: un anticuerpo que se une a una subunidad alfaV de un receptor integrina humano heterodimérico conjugado a un agente citotóxico con una CI50 de 10-9 M o menos,

en el que el conjugado de anticuerpo-fármaco ejerce un efecto citotóxico o citostático sobre una línea celular de cáncer que expresa integrina alfaV, de fórmula:**Fórmula**

en el que el anticuerpo es un anticuerpo específico contra la subunidad de integrina alfaV humana, en el que dicho anticuerpo es capaz de ser internalizado por la célula que expresa dicha subunidad alfaV; en el que el maitansinol está esterificado en C-3; R1, R2, X1 y X2 son independientemente H, Me, C2H5, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un resto arilo heterocíclico, o un resto heterocicloalquilo; n es 1 - 5; p es 1 - 5; y m es de 1 a 10, y las sales y ésteres farmacéuticamente aceptables del mismo.

Campo de la invención

La invención se refiere a conjugados de anticuerpos específicos contra tumores con compuestos citotóxicos. Los conjugados preferentes contienen compuestos de maitansinoide unidos a un anticuerpo anti-integrina mediante un enlace disulfuro.

Antecedentes de la invención

Se han realizado numerosos intentos para mejorar la eficacia de los medicamentos antineoplásicos conjugando tales fármacos con anticuerpos monoclonales (AcMo) contra antígenos asociados a tumores a fin de elevar la concentración local del fármaco mediante la administración dirigida al tumor. A la inversa, el potencial de los anticuerpos para destruir realmente las células tumorales está limitado a aquellos anticuerpos dirigidos al bloqueo de estímulos proliferativos, tales como los factores de crecimiento EGF y Her-2 mediante el bloqueo de la unión del ligando a los receptores o el bloqueo de la señalización de los receptores (ErbB1 y ErbB2) o aquellos que inducen funciones efectoras (ADCC o CDC). Por lo tanto, se ha buscado un producto que combine la especificidad de un AcMo con el potencial destructor de un veneno metabólico. Los ejemplos de los primeros son el AcMo BR96 conjugado a doxorrubicina (Braslawsky, et al. Cáncer Immunol Immunother 33:367-374, 1991) y la exotoxina de Pseudomonas fusionada a fragmentos o anticuerpos contra el factor de crecimiento (Kreitment, et al., Internal Immunopharm 14(3):465-72, 1992).

Estos intentos se han encontrado con limitaciones imprevistas, tales como el requisito de unas concentraciones intracelulares relativamente altas de la toxina en comparación con el número de sitios de unión externos por célula. Si se estima que el número de antígenos asociados a tumores en la superficie de las células cancerosas es de 15 moléculas/célula, los agentes citotóxicos que pueden utilizarse de manera eficaz en estos conjugados deben tener un valor de CI5 de 1'1°-1'11 M contra las células cancerosas diana. (Chari, R.V.J. Adv. Drug Delivery Rev. 1998, 31, 89-14). En segundo lugar, el fármaco debe ser liberado tras la unión a la diana y penetrar en la célula o todo el constructo debe ser transportado al interior de la célula y la toxina ser escindida o activada allí de otra manera.

Algunos de estos inconvenientes pueden resolverse en mayor o menor medida utilizando un fármaco muy potente conjugado a un anticuerpo de internalización y utilizando un enlace químico que tenga una labilidad potenciada en condiciones intracelulares. Chari et al. (Cáncer Res 52:127-131, 1992; Liu et al., Proc. Nati. Acad Sci EE.UU. 93: 8618-8623, 1996; patente de EE.UU. N° 5.28.2) desarrollaron conjugados de anticuerpo en los que el anticuerpo está unido a un maitansinoide a través de un enlace disulfuro.

Los maitansinoides son antifúngicos y antitumorales derivados de plantas. S.M. Kupchan et al. informaron por primera vez acerca del aislamiento de tres ansamacrólidos de extractos etanólicos de Maytenus ovatus y Maytenus buchananii y es el objeto de la patente de EE.UU. N° 3.896.111, junto con la demostración de sus efectos antileucémicos en modelos murinos en el margen posológico de microgramos/kg. Sin embargo, los maitansinoides tienen una toxicidad inaceptable, provocando neuropatías centrales y periféricas, y efectos secundarios: particularmente náuseas, vómitos, diarrea, elevaciones de las pruebas de función hepática y, con menor frecuencia, debilidad y letargo. Por lo tanto, ha sido un foco de investigación durante algún tiempo encontrar el resto de direccionamiento correcto junto con un proceso químico adecuado para conformar un conjugado de maitansina-anticuerpo con una semivida de degradación aceptable.

A diferencia de la elevada citotoxicidad del maitansinoide libre, un conjugado de anticuerpo tiene una toxicidad que es varios órdenes de magnitud menor en células negativas para el antígeno en comparación con las células positivas para el antígeno. El enlace mediante unión disulfuro tiene la ventaja de que estos enlaces son escindidos fácilmente en el interior de las células diana por el glutatión intracelular, liberando el fármaco libre altamente tóxico. Este enfoque ha sido aplicado a anticuerpos contra antígenos asociados a tumores, por ejemplo, el conjugado C242-DM1 (Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci EE.UU. 93:8618-8623, 1996) y HuN91-DM1 (Chari et al., 2). Sin embargo, la aplicación de estos conjugados está restringida debido a la expresión limitada de los respectivos antígenos diana.

Por lo tanto, todavía existe la necesidad de mejorar este enfoque utilizando anticuerpos dirigidos contra los antígenos asociados a tumores más altamente expresados, y, opcionalmente, antígenos altamente expresados durante las etapas proliferativa y metastásica de la malignidad, permitiendo así una concentración natural de toxina contra las células más virulentas.

Anticuerpos monoclonales anti-intearina

Existen pruebas considerables de que el crecimiento progresivo del tumor depende de la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, para proporcionar a los tumores nutrientes y oxígeno, para llevar los productos de desecho y actuar como conductos para la metástasis de las células tumorales a sitios distantes (Gastl et al., Onco1.54: 177-184). Estudios recientes han definido adicionalmente las funciones de las integrinas en el proceso de angiogénesis. Durante la angiogénesis, varias integrinas que se expresan en la superficie de las células endoteliales activadas regulan las interacciones de adhesión fundamentales con diversas proteínas ECM para regular eventos biológicos distintos tales como la migración, la proliferación y la diferenciación celular. Específicamente, las integrinas aV(33 y aV(35, estrechamente relacionadas pero distintas, han demostrado mediar vías independientes en el proceso de angiogénesis. Un anticuerpo generado contra aV(33 bloqueaba la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento del fibroblasto básico (bFGF), mientras que un anticuerpo específico contra aVp5 inhibía la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) (Eliceiri, et al., J. Clin. Invest. 13:1227-123 (1999); Friedlander et al., Science 27: 15-152 (1995)). Por lo tanto, las integrinas y especialmente las integrinas que contienen la subunidad alfa V, son objetivos terapéuticos razonables para enfermedades que implican angiogénesis tales como la enfermedad del ojo y la enfermedad neoplásica, el remodelado tisular tal como la restenosis, y la proliferación de determinados tipos de células, particularmente carcinomas de células epiteliales y de células escamosas. Se ha descrito CNTO 95, un anticuerpo monoclonal totalmente humano que Inhibe las Integrinas alfa V (Trlkha, etal. Int J. Cáncer 11 (3): 326-335 (24)).

Conjugados de anticuerpo-fármaco

Se han descrito conjugados de agentes de unión celular con la maitansina altamente citotóxica (patentes de EEUU. N° 5.28.2 y 5.416.64; R.V.J. Chari etal., 1992 Cáncer Res. 52:127-131). Se han desarrollado determinados reactivos o reaccionantes tales como ésteres de N-hidroxisuccinimidil (NHS) para la reacción con grupos amino de proteínas para su uso en la formación de conjugados fármaco-proteína. Los reactivos de este tipo han sido descritos en general por Carlsson et al. (Biochem J. 173: 723, 1978 y en la patente de EE UU. N° 4.149.3). En el documento W24/1681 se describen reactivos conectares de nitro-piridilo para la conjugación de la maitansina con los AcMo y otras proteínas.

En los procesos anteriormente referenciados, los agentes de unión celular se modifican con un agente bifuncional tal como N-Succ¡nimidil-3-(2-p¡r¡d¡ldit¡o)propionato (SPDP) para introducir un resto disulfuro activo. La reacción con un fármaco citotóxico que contiene tiol proporciona un conjugado en el que el agente de unión celular, tal como un anticuerpo monoclonal, y el fármaco se unen a través de enlaces disulfuro. Se descubrió que la posición hidroxilo C-3 podía modificarse sin pérdida de actividad, de hecho, se descubrió que determinados ésteres tenían una actividad destructora de células potenciada (para una revisión véase Cassady, et al. Chem Pharm Bull 52(1): 1- 26, 24). Las patentes de EE UU. N° 5.28.2 y 5.416.64 instruyen específicamente sobre el uso del éster de maitansol de N-metll-N-(3-met¡ld¡tiopropanoil)-L-alanina activado. El resto maitansoide de esta reacción, y que se libera tras la escisión reductora del enlace disulfuro, se ha denominado DM1 [N2-desacet¡l-N2-(3-mercapto-1- oxopropil)-maitansina, CAS Reg. N° 13954-5-], Por lo tanto, todos los conjugados preparados utilizando la forma metilditiolada de DM1 conservan un carbono del metileno no sustituido adyacente al enlace disulfuro en el lado del fármaco del conjugado (Fig.... [Seguir leyendo]

1. Conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende: un anticuerpo que se une a una subunidad alfaV de un receptor integrina humano heterodimérico conjugado a un agente citotóxico con una CI5 de 1'9 M o menos, en el que el conjugado de anticuerpo-fármaco ejerce un efecto citotóxico o citostático sobre una línea celular de cáncer que expresa integrina alfaV, de fórmula:

ANTICUERPO

en el que el anticuerpo es un anticuerpo específico contra la subunidad de integrina alfaV humana, en el que dicho anticuerpo es capaz de ser internalizado por la célula que expresa dicha subunidad alfaV; en el que el maitansinol está esterificado en C-3; R-i, R2, X1 y X2 son independientemente H, Me, C2Hs, alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 1 átomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o cíclico que tiene de 3 a 1 átomos de carbono, fenilo, fenilo sustituido, o un resto arilo heterocíclico, o un resto heterocicloalquilo; n es 1 - 5; p es 1 - 5; y m es de 1 a 1, y las sales y ásteres farmacéuticamente aceptables del mismo.

2. Conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo compite por la unión a la integrina alfaV humana con el anticuerpo monoclonal CNTO 95 o un fragmento del mismo.

3. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 1, en el que la molécula de anticuerpo es el anticuerpo monoclonal CNTO 95 o un anticuerpo recombinante que tiene al menos una de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de CNTO 95 que tienen la secuencia de aminoácidos déla SEQ ID NO: 1-6 o sustituciones conservadoras de al menos una CDR.

4. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo monoclonal compite con el AcMo CNTO 95 que se une a las células vivas que expresan integrina alfaVbeta3 humana.

5. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 1, en el que la molécula de anticuerpo es específica para un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9.

6. Conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

7. Conjugado según la reivindicación 1, en el que el número medio de residuos citotóxicos unidos a la molécula de anticuerpo es de entre 3 y 4.

8. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 1 en el que n = 2, R1 y R2 son ambos metilo, X1 y X2 son H y p es

2.

9. Método de producción de un conjugado según la reivindicación 1, que comprende las etapas: (a) introducir uno o más grupos tiol libres o protegidos en una molécula de anticuerpo que se une a una subunidad alfaV de un receptor

integrina humano heterodimérico; (b) hacer reaccionar la molécula de anticuerpo de la etapa (a) con un compuesto que es un agente citotóxico con una CI5o de 1'9 M o menos, teniendo dicho compuesto uno o más grupos tiol o disulfuro; y (c) recuperar el conjugado resultante, en el que el compuesto tóxico es un maitansinoide.

1. Método según la reivindicación 9, en el que se utiliza éster de N-hidroxisuccinimida del ácido (2-piridll)-3- ditiopropanoico (SPDP), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido (2-plridil)-4-ditiopentanoico (SPP) o éster de N- hldroxlsucclnlmlda del ácido (2-piridil)-4-ditlobutanoico (SPDB) para Introducir los grupos tiol libres o protegidos en la molécula de anticuerpo.

11. Composición farmacéutica que comprende un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en medicina, preferentemente para uso en el tratamiento del cáncer.

13. Conjugado según la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento del adenocarcinoma de mama, el adenocarclnoma pulmonar, el adenocarcinoma de páncreas, el adenocarcinoma de colon, el carcinoma de células renales o el adenocarcinoma de estómago.

14. Conjugado según la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, el carcinoma de células escamosas del esófago, el carcinoma de células escamosas del pulmón, el carcinoma de células escamosas de la piel o el carcinoma de células escamosas del cuello uterino.

15. Conjugado según la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento o la prevención de la propagación metastásica del cáncer.

16. Conjugado de anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que impide que CNTO 95 se una a las células vivas que expresan integrina alfaVbeta3 humana para uso en medicina, preferentemente para su uso en la Inhibición del crecimiento de células cancerosas en un mamífero.

17. Conjugado para su uso según la reivindicación 16, en el que el conjugado de anticuerpo se administrará por vía intravenosa.

18. Conjugado para su uso según la reivindicación 17, en el que el conjugado de anticuerpo se administrará en una cantidad de ,5 mg/kg a 12, mg/kg de peso corporal.

19. Conjugado para su uso según la reivindicación 16, en el que el mamífero es un paciente humano.

2. Conjugado de anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que impide que CNTO 95 se una a las células vivas que expresan integrina alfaVbeta3 humana para su uso en la inhibición de la angiogénesis en un mamífero con una enfermedad dependiente de la angiogénesis seleccionada del grupo que consiste en la metástasis cancerosa, el angioma, el angiofibroma, la retinopatía diabética, la retinopatía del prematuro, el glaucoma neovascular, una enfermedad corneal inducida por la angiogénesis, la involución macular, la degeneración macular, el pterigio, la degeneración retiniana, la fibroplasia retrolental, la conjuntivitis granular, la psoriasis, la telangiectasia, el granuloma piógeno, la dermatitis seborreica, el acné y la artritis.

21. Conjugado de anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que impide que CNTO 95 se una a las células vivas que expresan integrina alfaVbeta3 humana para su uso en la mejora de una enfermedad inflamatoria en un mamífero, en la que dicha enfermedad inflamatoria está seleccionada del grupo que consiste en la artritis reumatoide, la degeneración macular, la psoriasis, la retinopatía diabética.

22. Conjugado de anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que impide que CNTO 95 se una a las células vivas que expresan integrina alfaVbeta3 humana para tratar un trastorno cutáneo angiogénico seleccionado del grupo que consiste en la psoriasis, las úlceras venosas, el acné, la rosácea, las verrugas, el eczema, los hemangiomas y la linfangiogénesis.

23. Conjugado de anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que impide que CNTO 95 se una alas células vivas que expresan integrina alfaVbeta3 humana para tratar un trastorno que implica la neovascularización de la córnea o de la retina.

24. Conjugado para su uso según la reivindicación 22 ó 23 en el que el conjugado de anticuerpo se administra en combinación con un segundo agente o modalidad terapéutica o profiláctica.

25. Artículo de fabricación que comprende la composición de conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un recipiente, y que comprende adicionalmente un prospecto o etiqueta que indica que la composición puede utilizarse para tratar una enfermedad caracterizada por células que expresan integrina con subunidad alfaV.

26. Artículo de fabricación según la reivindicación 25 en el que el prospecto indica que la composición puede utilizarse para tratar el cáncer.

27. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 1, en el que n = 2, Ri y R2 son ambos metilo.

28. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende (i) todas las secuencias de aminoácidos de la región determinante de complementariedad (CDR) de la cadena pesada de CNTO 95 como se muestra en las SEQ ID NO: 1, 2, y 3, y (ii) todas las secuencias de aminoácidos de la CDR de la cadena ligera de CNTO 95 como se muestra en las SEQ ID NO: 4, 5 y 6.

29. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 28, en el que al menos una de las secuencias de la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada de CNTO 95 como se muestra en la SEQ ID NO: 7.

3. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 28, en el que al menos una de las secuencias de la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de la región variable de la cadena ligera de CNTO 95 como se muestra en la SEQ ID NO: 8.

31. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada de CNTO 95 como se muestra en la SEQ ID NO: 7 y una región variable de la cadena ligera de CNTO 95 como se muestra en la SEQ ID NO: 8.

32. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es el anticuerpo monoclonal CNTO 95.