Inhibidores peptídicos para mediar respuestas de estrés.

Un péptido que comprende un epítopo inmunorreactivo con un anticuerpo anti-idiotípico dirigido contra un anticuerpo anti-p53,

en el que el anticuerpo anti-p53 es inmunorreactivo con al menos una parte del dominio regulador del extremo C-terminal de p53, y en el que el péptido muestra al menos una actividad seleccionada entre actividad anti-apoptótica y actividad antiinflamatoria, en el que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en una cualquiera de las SEC ID Nº: 1-8.

Inhibidores peptídicos para mediar respuestas de estrés Campo de la invención

La presente invención se refiere a péptidos reconocidos por anticuerpos anti-idiotípicos dirigidos contra un anticuerpo anti-p53, siendo capaces estos péptidos de inhibir las respuestas de estrés celular e inmune en una célula eucariota, para el tratamiento de trastornos degenerativos e inflamación en seres humanos.

Antecedentes de la invención

Apoptosis

La apoptosis, o muerte celular programada, tiene una importancia fundamental para los procesos biológicos normales, incluyendo la embriogénesis, mantenimiento de la homeostasis de tejidos, desarrollo celular de organismos multicelulares, eliminación de células infectadas por virus, y el desarrollo del sistema inmune (Ellis et al., 1991). Es un tipo de muerte celular que es fundamentalmente distinto de la muerte degenerativa o la necrosis en que es un proceso activo de autodestrucción celular dirigida por genes, el cual, en algunos casos, cumple una función homeostática biológicamente significativa.

p53

La proteína p53, originalmente identificada como un antígeno asociado a tumores, es el producto de un gen supresor de tumores que funciona deteniendo el crecimiento de células mutadas o aberrantes (Baker et al., 199). Se cree que la p53 funcional detecta el daño en el ADN (Lee et al., 1995) y por consiguiente induce la reparación del ADN (Kastan et al., 1991), la detención del crecimiento (Kuerbitz et al., 1992), o la apoptosis (Yonish-Rouach et al., 1991) de las células aberrantes. En particular, p53 controla la estabilidad genómica eliminando células genéticamente dañadas de la población de células, y una de sus principales funciones es prevenir la formación de tumores.

La proteína p53 tiene al menos dos sitios de unión a ADN:

(1) el núcleo de la proteína p53, que interactúa específicamente con una secuencia de ADN en la región promotora de genes que responden a p53 (el-Deiry et al., 1992); y

(2) el extremo C-terminal de la proteína p53, que puede reconocer características comunes al ADN dañado en general (Lee et al., 1995; Foord et al., 1991).

La proteína p53 es un factor de transcripción que se une específicamente a un sitio consenso presente en las secuencias reguladores de genes dependientes de p53 (el-Deiry et al., 1992). La mutación del gen de p53 en el dominio que codifica las secuencias implicadas en la unión a los sitios reguladores de ADN específicos causa una pérdida de supresión tumoral. Por lo tanto, no es sorprendente que una proporción significativa de tumores humanos naturales porten p53 mutada (Hollstein et al., 1991).

p53 tiene una semivida corta, y, por consiguiente, se sintetiza y degrada en la célula de manera continua. Sin embargo, cuando se somete a una célula a estrés, p53 se estabiliza. Los ejemplos de estreses celulares que inducen la estabilización de p53 son:

a) daño en el ADN, tal como daño causado por radiación UV (ultravioleta), mutaciones celulares, quimioterapia, y radioterapia;

b) hipertermia;

c) hipoxia; y

d) desregulación de los microtúbulos causada por algunos fármacos quimioterapéuticos, por ejemplo, tratamiento usando taxol o alcaloides de la vinca.

La p53 activada por estrés induce una cascada de eventos que dan como resultado una detención del crecimiento o la apoptosis de la célula estresada, de este modo previniendo el sobrecrecimiento de células aberrantes y la formación de tumores (Ko, 1996). Sin embargo, la activación excesiva de p53 después de un estrés grave puede ser perjudicial para el organismo, y puede deteriorarse la función de los tejidos por una apoptosis excesiva (Komarova, 21).

Específicamente, la radioterapia y la quimioterapia muestran efectos secundarios graves, tales como daño grave al sistema linfoide y hematopoyético y a los epitelios intestinales, que limitan la eficacia de estas terapias. Otros efectos secundarios, como la pérdida del cabello, también están mediados por p53 y desvirtúan además las terapias contra el cáncer. Por lo tanto, para eliminar o reducir efectos secundarios adversos en los tejidos normales asociados con el

tratamiento del cáncer, podría ser beneficioso inhibir la actividad de p53 en los tejidos normales durante el tratamiento de tumores deficientes en p-53, y de este modo proteger a los tejidos normales.

La inactivación de p53 se ha considerado un suceso indeseable y no deseado, y se ha efectuado un esfuerzo considerable para facilitar el tratamiento del cáncer restaurando la función de p53. Sin embargo, la restauración o imitación de p53 causa los problemas anteriormente descritos con respecto al daño de células de tejidos normales durante la quimioterapia o radioterapia. Estas células normales están sometidas a estrés durante la terapia contra el cáncer, lo que conduce a que p53 en la célula cause una muerte programada. El tratamiento del cáncer, por lo tanto, elimina tanto a células tumorales como a células normales.

La Patente de los Estados Unidos N° 6.593.353 divulga inhibidores de p53 en el tratamiento de enfermedades, afecciones y lesiones mediadas por p53.

La Patente de los Estados Unidos N° 6.42.136 divulga métodos para modular la actividad de la proteína p53 en células mediante la adición de una proteína que potencia o inhibe la actividad bioquímica de p53.

La Patente de los Estados Unidos N° 6.63.584 divulga un anticuerpo monocatenario que reconoce un epítopo expuesto en p53 muíante, pero no en la de tipo silvestre, y una molécula de ADN que codifica al Fv monocatenario, composiciones farmacéuticas que comprenden al anticuerpo y métodos de tratamiento usando las composiciones farmacéuticas.

p53 y respuesta asociada al estrés

Los efectos adversos de la actividad de p53 en un organismo no están limitados a las terapias contra el cáncer. p53 se activa como consecuencia de una variedad de estreses asociados con lesiones (por ejemplo, quemaduras), enfermedades de origen natural (por ejemplo, hipertermia asociada con la fiebre, y afecciones de hipoxia local asociadas con un suministro bloqueado de sangre, ictus, e isquemia) y con el envejecimiento celular (por ejemplo, senescencia de fibroblastos), así como una terapia contra el cáncer. La inhibición temporal de p53, por lo tanto, también puede ser terapéuticamente eficaz en: (a) reducir o eliminar la muerte neuronal dependiente de p53 en el sistema nervioso central, es decir, lesión en el cerebro y médula espinal, (b) la conservación de tejidos y órganos antes de trasplantarlos, (c) preparación de un hospedador para un trasplante de médula ósea, y (d) reducir o eliminar el daño neuronal durante ataques, por ejemplo.

Además, varias enfermedades degenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, ictus isquémico (Mattson, 21; Martin, 21), glaucoma (Nickells, 1999) degeneración secundaria después de un traumatismo (Raghupathi, 2), infarto de miocardio (Haunstetter, 1998) están asociadas con la muerte celular excesiva del tejido sensible en respuesta al estrés. Por lo tanto, la inhibición temporal de la muerte celular relacionada con estrés puede servir para la prevención y terapia de enfermedades degenerativas (Komarova, 21).

Anticuerpo monoclonal para el dominio de unión a ADN de p53

Los anticuerpos para ADN son característicos de muchas enfermedades autoinmunes, de manera destacable, lupus sistémico eritematoso (LSE) y particularmente nefritis por lupus. Sin embargo, actualmente no hay una explicación aceptada de manera general para la prevalencia de anticuerpos anti-ADN en trastornos autoinmunes. La inmunidad para el ADN parece estar dirigida por un antígeno (Radie etal., 1994), pero es improbable que el ADN propio dirija al antígeno ya que normalmente en ADN de mamífero no induce una respuesta inmune anti-ADN (Pisetsky, 1996).

Se ha comunicado que la inmunización con anticuerpos monoclonales puede inducir respuestas inmunes que se extienden más allá de la especificidad del anticuerpo, probablemente, mediante conectividad anti-idiotípica basada en determinantes idiotípicos en las regiones variables del anticuerpo monoclonal inmunizante.

De acuerdo con la terminología de red de anticuerpo idiotípico, Ab1 es el primer anticuerpo, el anticuerpo que se une al antígeno, y Ab2 es el anticuerpo anti-idiotípico para Ab1. La región variable de Ab2 puede imitar la conformación del antígeno ya que tanto el antígeno como Ab2 pueden unirse mediante Ab1. Ab3 es el anticuerpo anti-idiotípico para Ab2. Debido a la cadena de complementariedad estructural, Ab1 y Ab3 pueden tener una especificidad similar para el antígeno original.

El anticuerpo PAb-421... [Seguir leyendo]

1. Un péptido que comprende un epítopo inmunorreactivo con un anticuerpo a nti-i di otípico dirigido contra un anticuerpo anti-p53, en el que el anticuerpo ant¡-p53 es inmunorreactivo con al menos una parte del dominio regulador del extremo C-terminal de p53, y en el que el péptido muestra al menos una actividad seleccionada entre actividad anti-apoptótica y actividad antiinflamatoria, en el que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en una cualquiera de las SEC ID N°: 1-8.

2. El péptido de la reivindicación 1,

en el que dicho péptido comprende 7 o 12 aminoácidos; o en el que el anticuerpo anti-p53 es PAb-421; o

en el que el péptido inhibe la actividad apoptótica en al menos un 25 %, preferentemente en al menos un 5 %, más preferentemente en al menos un 75 % y lo más preferentemente en al menos un 95 %; o

en el que el péptido es capaz de regular negativamente las respuestas de estrés mediadas por el sistema inmune; o en el que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en una cualquiera de las SEC ID N°: 1, 2 y 5; o

en el que el anticuerpo anti-idiotípico es una molécula que comprende secuencias de VL-CDR3 y VH-CDR3 seleccionadas del grupo que consiste en: SEC ID N°: 15 y 18, y SEC ID N°: 21 y 24; o

en el que el anticuerpo anti-idiotípico es una molécula que comprende reglones VL y regiones Vh seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID N°: 9 y 1, SEC ID N°: 11 y 12.

3. El péptido de la reivindicación 1, en el que el péptido muestra la actividad de unirse a una proteína implicada en la apoptosis o prevenir que una proteína implicada en la apoptosis se una al ADN dañado.

4. El péptido de la reivindicación 1, en el que el péptido inhibe la actividad apoptótica de células de mamífero, preferentemente células de ser humano.

5. Una composición farmacéutica que comprende como principio activo un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y/o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

6. El uso de un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de un medicamento para modular las respuestas celulares e inmunes asociadas con el estrés en una célula de un organismo.

7. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en la modulación de las respuestas celulares e inmunes asociadas al estrés en una célula de un organismo.

8. El uso de la reivindicación 6 o el péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que las respuestas son muerte celular o respuestas mediadas por p53 y en el que el estrés se induce mediante estímulos seleccionados del grupo que consiste en agentes que dañan al ADN, hipertermia, estrés tóxico y radiación y.

9. El uso de la reivindicación 6 o el péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la respuesta asociada al estrés está asociada a un trastorno seleccionado del grupo que consiste en: enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, degeneración secundaria después de traumatismo, ictus, intoxicación del SNC, glaucoma, degeneración macular, diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple, lupus sistémico eritematoso, uveítis autoinmune, enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de injertos, artritis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), enfermedad inflamatoria del intestino (Eli), síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA), psoriasis, aterosclerosis, infarto de miocardio, enfermedad por radiación, hipertermia, hipoxia, hígado tóxico fulminante, insuficiencia renal e infertilidad.

1. El uso de la reivindicación 6 o el péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el péptido se administra a un sujeto que lo necesite a través de una ruta seleccionada entre oral, tópica, transdérmica y parenteral; o en el que el péptido inhibe la actividad apoptótica en respuesta a trastornos de estrés celular e inmune en tejido o células normales.

11. El uso de un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una afección o trastorno degenerativo en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el tratamiento administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido.

12. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en el tratamiento de un trastorno o afección degenerativa en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el tratamiento administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido.

13. El uso de la reivindicación 11 o el péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho sujeto tiene un trastorno neoplásico y puede estar sometiéndose a quimioterapia y/o radioterapia para el tratamiento del cáncer; o en el que la enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en: enfermedad de Alzheimer,

esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parklnson, degeneración secundaria después de traumatismo, ictus, Intoxicación del SNC, glaucoma, degeneración macular, Infarto de miocardio, ataques, enfermedad por radiación, hlpertermla, hipoxia, hígado tóxico fulminante, Insuficiencia renal e Infertilidad; o en el que el péptido se administra a un sujeto que lo necesite a través de una ruta seleccionada entre oral, tópica, transdérmlca y parenteral.

14. El uso de un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar una enfermedad o afección Inflamatoria en un sujeto que lo necesite.

15. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en el tratamiento de una 1 enfermedad o afección inflamatoria en un sujeto que lo necesite.

16. El uso de la reivindicación 14 o el péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la enfermedad es una enfermedad autoinmune; o en el que la enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en: diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple, lupus sistémico eritematoso, uveítis autoinmune, artritis,

síndrome de respuesta inflamatoria slstémica (SRIS), enfermedad inflamatoria del intestino (Eli), síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA), psoriasis, aterosclerosls, rechazo de injerto y enfermedad de injerto contra hospedador; o

en el que la enfermedad es esclerosis múltiple; o

en el que el péptido se administra a un sujeto que lo necesite a través de una ruta seleccionada entre oral, tópica, 2 transdérmica y parenteral.