Estabilización de composiciones acuosas de proteínas con tampones de desplazamiento.

Un recipiente hermético que contiene una composición acuosa que comprende una proteína y dos tampones de desplazamiento,

en la que un tampón de desplazamiento tiene un pKa que es al menos 1 unidad mayor que el pH de la composición, y un tampón de desplazamiento tiene un pKa que es al menos 1 unidad inferior al pH de la composición, fijándose dicho pH de la composición a un valor al que la composición tiene una estabilidad máxima medible con respecto al pH, en la que uno de los tampones es TRIS, con la condición de que dicha composición contenga no más de 2 mM de un tampón convencional con un pKa que esté dentro de una unidad de pH del pH de la composición, y en la que cada tampón de desplazamiento esté presente a una concentración de 2 a 200 mM.

Estabilización de composiciones acuosas de proteínas con tampones de desplazamiento Campo de la invención

Esta invención se refiere a la estabilidad de proteínas, particularmente a la estabilidad de proteínas en sistemas acuosos, por ejemplo en disolución acuosa o en forma de gel acuoso.

Antecedentes de la invención

Muchas proteínas, por ejemplo, las enzimas, anticuerpos o proteínas terapéuticas son inestables, y son susceptibles de una degradación estructural y consiguiente pérdida de actividad mientras se almacenan, particularmente en disoluciones acuosas. Los procesos implicados en la degradación de las proteínas pueden dividirse en físicos (es decir, procesos que afectan a las interacciones no covalentes, tales como pérdida de estructura cuaternaria, terciaria o secundaria, agregación, adsorción superficial) y químicos (es decir, procesos que implican un cambio covalente tales como desamidación, oxidación, intercambio de disulfuro, etc.). Las velocidades de los procesos de degradación son proporcionales a la temperatura. Las proteínas son por lo tanto generalmente más estables a temperaturas más bajas.

En general, las proteínas son más estables en ausencia de agua. Las proteínas más comerciales se formulan por lo tanto como polvos liofilizados. Una formulación de proteína comercial liofilizada típica comprende siempre un tampón, tal como tampón de fosfato, y uno o más aditivos. Los aditivos pueden incluir uno o más de los siguientes:

Agentes de carga: Típicamente azúcares o alditoles, tales como sorbitol o manitol.

Estabilizantes: típicamente azúcares de reemplazo de agua, tales como trehalosa o sacarosa, que pueden proteger la estructura de la proteína durante la liofilización.

Modificadores de la tonicidad: Típicamente sales inorgánicas y aminoácidos (comúnmente glicina o arginina). Estos excipientes se usan para ajustar la fuerza iónica. La fuerza iónica es a menudo un parámetro importante de la formulación de la proteína tanto durante el procedimiento de liofilización como en la aplicación específica de la proteína después de la reconstitución.

Tensioactivos: Pueden ser eficaces para impedir la adsorción de las proteínas sobre superficies sólidas, agregación inducida por agitación y daño durante la liofilización.

Se conocen algunas proteínas que se formulan en disoluciones. Históricamente, esto reduce considerablemente el coste de producción a expensas de una baja estabilidad. Las disoluciones acuosas de proteínas se formulan a menudo en una etapa temprana de desarrollo de un producto de proteína, durante la cual las exigencias de estabilidad no son tan estrictas como las del producto final. Típicamente, las disoluciones acuosas de proteínas tienen que almacenarse estrictamente a 4°C. En la mayor parte de los casos, la degradación estructural y pérdida de actividad se producen incluso a esta temperatura durante un periodo de almacenamiento. La estabilidad de formulaciones acuosas puede mejorarse mediante congelación, pero en algunos casos el ciclo de congelación- descongelación puede contribuir al daño de la proteína.

Una disolución acuosa de proteína típica se formula en un tampón convencional, lo más comúnmente en tampón de fosfato de pH 6,8 - 7,3, aunque también se usan otros tampones, tales como HEPES, TRIS, carbonato o citrato. Las formulaciones pueden comprender también uno o más de los siguientes aditivos:

Modificadores de la tonicidad: típicamente sales inorgánicas y aminoácidos (comúnmente glicina o arginina). Estos excipientes se usan para ajustar la fuerza iónica, un parámetro importante de la formulación de la proteína.

Tensioactivos: pueden ser eficaces para impedir la adsorción de las proteínas sobre superficies sólidas o la agregación inducida por agitación.

Estabilizantes: típicamente azúcares de reemplazo de agua, tales como trehalosa o sacarosa.

Estos son conocidos por afectar el punto de fusión de las proteínas y pueden por lo tanto mejorar la estabilidad de las proteínas.

Como se ha mostrado anteriormente, la naturaleza de los aditivos en formulaciones comerciales de proteínas puede variar. Sin embargo, la característica común de las formulaciones comerciales de proteínas tanto en formato seco como acuoso es la presencia de un tampón. Se necesita un tampón para mantener el pH de la formulación cercano a un valor dado. Muchas proteínas comerciales se formulan en tampón de fosfato a un pH cercano a 7. En algunos casos, pueden usarse otros tampones y otros pH. Formular a un pH separado de 7 está determinado típicamente

por la necesidad de aumentar la solubilidad de las proteínas, lo que puede lograrse a un pH separado del punto isoeléctrico de la proteína.

La elección del tampón para formular proteínas sigue las reglas bien definidas de los equilibrios ácido-base y la teoría de ácido-base de Bnansted-Lowry. Los equilibrios ácido-base se refieren al intercambio de protones (H+; a los 5 que también se hace referencia como cationes de hidrógeno) entre dos especies químicas. Mientras que se hace referencia a la especie que dona el protón como el ácido, se hace referencia a la especie que acepta el protón como la base. Así, en el siguiente proceso reversible,

HA + B' HB + A'

HA actúa como ácido y B' actúa como base. En el sentido opuesto HB actúa como ácido y A- actúa como base. La 1 capacidad de un compuesto para donar o aceptar protones se expresa mediante la constante de disociación Ka, que describe el equilibrio entre la forma protonada y desprotonada de un compuesto en disolución acuosa, como sigue:

HX + H2 H3+ + X

Keq=[H3+][X-]/[HX][H2]

Ya que [H2] = constante = 55,5 M entonces:

Ka = Keq[H2]=[H3+][X-]/[HX]

pKa = -log Ka

El pKa de cualquier especie es función de la temperatura. Mientras que en muchos casos, tales como con fosfato, citrato o acetato, la dependencia de la temperatura es pequeña, algunos tampones (tales como TRIS/HCI) muestran un cambio de pKa tanto como ,3 unidades por °C.

El grado de protonación de una especie química con un valor de pKa dado depende del pH de la disolución. Si pH = pKa de la especie en cuestión, entonces 5% de la especie existe en forma protonada y el restante 5% en forma desprotonada. SI el pH es una unidad inferior al pKa entonces 9% de la especie existe en forma protonada y 1% en forma desprotonada. De manera similar, si el pH es una unidad superior al pKa entonces 1% de la especie existe en forma protonada y 9% en forma desprotonada. Aunque el tanto por ciento de las formas protonada y 25 desprotonada de un compuesto permanece constante mientras que el pH y la temperatura son constantes, esto es resultado de un equilibrio dinámico entre el compuesto y las moléculas que lo rodean. En otras palabras, hay un intercambio dinámico continuo de protones entre las especies ácido-base en un sistema, mientras que el estado total de protonación de cada especie en la disolución se mantiene constante.

Donando o aceptando protones en el intervalo de pH en torno a su pKa, la especie actúa como tampón. La presencia 3 de un tampón da como resultado de este modo en pequeños cambios de pH si un ácido o una base se añade a la disolución. La especie ejerce una capacidad máxima de tamponamiento a pH = pKa, y su capacidad para mantener el pH desciende según el pH se aleja del pKa.

La elección del tampón apropiado depende generalmente del pH que se necesita. La regla generalmente aceptada es que el pKa del tampón no debe separarse más de una unidad del pH que se necesita para actuar como un 35 tampón eficaz. Preferiblemente, sin embargo, el pKa está dentro de un intervalo de ,5 unidades separado del pH que se necesita, para aumentar al máximo la capacidad de tamponamiento de la especie. Lo más preferiblemente, el pKa del tampón es igual al pH que se necesita de la disolución. En este caso, la proporción de la forma protonada y la forma desprotonada del tampón son 5% respectivamente, y su capacidad de tamponamiento se utiliza en toda su extensión. Tal disolución es entonces la más eficazmente protegida frente a los cambios de pH, tanto en el sentido 4 ácido como en el alcalino.

El documento de patente EP 1314437 describe una composición acuosa que comprende un anticuerpo e histidina, a pH 7,1. Esta composición se dice que es estable con respecto a la agregación. La descripción posterior sugiere que, para usarse, debe añadirse un tampón.

El documento de patente PCT/GB26/247 describe un sistema acuoso que comprende una proteína y uno o 45 más agentes estabilizantes. Los agentes estabilizantes tienen grupos ¡onlzables, capaces de intercambiar protones con la proteína... [Seguir leyendo]

1. Un recipiente hermético que contiene una composición acuosa que comprende una proteína y dos tampones de desplazamiento, en la que un tampón de desplazamiento tiene un pKa que es al menos 1 unidad mayor que el pH de la composición, y un tampón de desplazamiento tiene un pKa que es al menos 1 unidad inferior al pH de la composición, fijándose dicho pH de la composición a un valor al que la composición tiene una estabilidad máxima medióle con respecto al pH, en la que uno de los tampones es TRIS, con la condición de que dicha composición contenga no más de 2 mM de un tampón convencional con un pKa que esté dentro de una unidad de pH del pH de la composición, y en la que cada tampón de desplazamiento esté presente a una concentración de 2 a 2 mM.

2. Un recipiente hermético conforme a la reivindicación 1, en el que la composición acuosa comprende un

tensioactivo.

3. Un recipiente hermético conforme a la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que cada tampón de desplazamiento de la composición acuosa tiene un pKa que es de 1 a 5 unidades superior o inferior al pH de la composición.

4. Un recipiente hermético conforme a la reivindicación 3, en el que cada tampón de desplazamiento de la composición acuosa tiene un pKa que es de 1 a 4 unidades superior o inferior al pH de la composición.

5. Un recipiente hermético conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que cada tampón de desplazamiento de la composición acuosa está presente a una concentración de 5 a 1 mM.

6. Un recipiente hermético conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la composición acuosa

(i) la proteína es un antígeno de la hepatitis B y el pH es aproximadamente 5; o

(ii) la proteína es la hormona de crecimiento humana y el pH es aproximadamente 6.

7. Un recipiente hermético conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la composición acuosa la proteína es una enzima terapéutica.

8. Un recipiente hermético conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la composición acuosa la proteína es un anticuerpo terapéutico.

9. Un recipiente hermético conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la composición acuosa la proteína es una hormona de crecimiento humana.

1. Un recipiente hermético conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la composición acuosa la proteína es una vacuna.

11. Un recipiente hermético conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la composición acuosa la proteína es un factor de coagulación.

12. Un recipiente hermético conforme a la reivindicación 11, en el que en la composición acuosa la proteína es un factor de coagulación seleccionado de factor VIII y factor IX.

13. Un recipiente hermético conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la composición acuosa la proteína es insulina.

14. Un recipiente hermético conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la composición acuosa la proteína es interferón.

15. Un recipiente hermético conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la composición acuosa es para usar en tratamiento o diagnosis practicados en humanos o animales.