Un método para método para aumentar la estabilidad de una proteína en un sistema acuoso,

que comprende: (a) seleccionar un pH para la composición que está dentro de un intervalo de estabilidad de la proteína que es al menos 50% de la estabilidad máxima de la proteína con respecto al pH; y (b) preparar una composición que comprende la proteína y dos agentes estabilizantes, caracterizada porque: (i) los dos agentes estabilizantes tienen grupos ionizables capaces de intercambiar protones con la proteína y con los productos ionizados de la disociación del agua; (ii) los grupos ionizables consisten en primeros grupos que están cargados positivamente cuando están protonados y sin carga cuando están desprotonados, y segundos grupos que están sin carga cuando están protonados y cargados negativamente cuando están desprotonados, en los que los primeros y segundos grupos tienen valores de pKa, respectivamente, de 1 a 5 unidades de pH superiores y de 1 a 5 unidades inferiores al pH de la composición; y (iii) el pH de la composición está dentro de un intervalo de estabilidad de la proteína que es al menos 50% de la estabilidad máxima de la proteína con respecto al pH

Campo de la invención

Esta invención se refiere a sistemas acuosos estables que comprenden proteínas.

Antecedentes de la invención

La pérdida de la estructura terciaria natural de una proteína está asociada generalmente a la pérdida de su actividad biológica. Por tanto, es fundamental asegurar que una proteína activa (por ejemplo, una vacuna, proteína terapéutica, proteína diagnóstica, etc.) se conserve en condiciones en las que se mantenga la estructura terciaria natural.

La conservación de proteínas durante cualquier periodo de tiempo plantea problemas de estabilidad. Las fluctuaciones de la estructura son proporcionales a la temperatura. Las proteínas son, por lo tanto, generalmente más estables a temperaturas inferiores. Típicamente, las proteínas han de guardarse liofilizadas o congeladas (aproximadamente a -20ºC), para conservar su actividad biológica. Si se conserva liofilizada o congelada, la proteína ha de reconstituirse antes de su uso. Para una conservación de las proteínas durante un breve periodo, puede ser suficiente una refrigeración a 4ºC.

Las proteínas son macromoléculas que consisten en secuencias de 20 aminoácidos diferentes presentes en la naturaleza. Siete de estos aminoácidos (ácido aspártico, ácido glutámico, histidina, cisteína, tirosina, lisina y arginina) contienen una cadena lateral capaz de tomar parte en equilibrios ácido-base. Esto significa que pueden aceptar o donar un protón dependiendo del pH y otras especies presentes en la disolución. La serina y la treonina son capaces también de intercambiar protones con las moléculas circundantes. Sin embargo, los valores de pKa de estos aminoácidos son extremadamente altos (>13,9), de modo que sus cadenas laterales están prácticamente siempre en una forma casi totalmente protonada.

El documento de patente EP 0513914 describe la estabilización de urato-oxidasa con ácido aspártico a una concentración de 750 mM. El documento de patente US 3051627 describe quimotripsina en agua con un aminoácido, a pH 4.

El documento de patente WO 03/009869 describe una composición que comprende un antígeno e histidina a pH 6-7, y que puede contener fosfato sódico. El documento de patente EP 1314437 describe una composición que comprende un anticuerpo en un tampón de glicina y/o un tampón de histidina a pH 5-8. El documento de patente EP 0948358 describe composiciones de interferón con acetato y arginina o glicina a pH 5,0, o con fosfato y arginina o glicina a pH 7,2.

Sumario de la invención

Conforme a un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para aumentar la estabilidad de una proteína en un sistema acuoso, que comprende:

(a) seleccionar un pH para la composición que está dentro de un intervalo de estabilidad de la proteína que es al menos 50% de la estabilidad máxima de la proteína con respecto al pH; y

(b) preparar una composición que comprende la proteína y dos agentes estabilizantes, caracterizada porque:

(i) los dos agentes estabilizantes tienen grupos ionizables capaces de intercambiar protones con la proteína y con los productos ionizados de la disociación del agua;

(ii) los grupos ionizables consisten en primeros grupos que están cargados positivamente cuando están protonados y sin carga cuando están desprotonados, y segundos grupos que están sin carga cuando están protonados y cargados negativamente cuando están desprotonados, en los que los primeros y segundos grupos tienen valores de pKa, respectivamente, de 1 a 5 unidades de pH superiores y de 1 a 5 unidades inferiores al pH de la composición;

y

(iii) el pH de la composición está dentro de un intervalo de estabilidad de la proteína que es al menos 50% de la estabilidad máxima de la proteína con respecto al pH.

Conforme a un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para aumentar la estabilidad de una proteína en un sistema acuoso, que comprende:

(a) seleccionar un pH para la composición que está dentro de un intervalo de ± 0,5 unidades de pH del pH al que la composición tiene una estabilidad máxima con respecto al pH; y

(b) preparar una composición que comprende la proteína y dos agentes estabilizantes, caracterizada porque:

(i) los dos agentes estabilizantes tienen grupos ionizables capaces de intercambiar protones con la proteína y con los productos ionizados de la disociación del agua;

(ii) los grupos ionizables consisten en primeros grupos que están cargados positivamente cuando están protonados y sin carga cuando están desprotonados, y segundos grupos que están sin carga cuando están protonados y cargados negativamente cuando están desprotonados, en los que los primeros y segundos grupos tienen valores de pKa, respectivamente, de 1 a 5 unidades de pH superiores y de 1 a 5 unidades inferiores al pH de la composición;

y

(iii) el pH de la composición está dentro de un intervalo de ± 0,5 unidades de pH del pH al que la composición tiene una estabilidad máxima con respecto al pH.

La composición preparada conforme a la invención puede comprender una proteína y uno o más agentes estabilizantes como se ha definido anteriormente, adsorbidos sobre un sólido.

En una realización, un método para identificar un pH apropiado para optimizar la estabilidad durante la conservación de una proteína en un medio acuoso, comprende determinar un pH con un valor en el intervalo de 4 a 9 a, o cerca de un valor, al cual la proteína está en un estado de equilibrio de intercambio de protones con respecto a sus alrededores, que esté optimizado para la estabilidad durante la conservación, es decir, en un estado de equilibrio óptimo de intercambio de protones.

El estado de equilibrio óptimo de intercambio de protones existe a un pH al cual se cumplen las siguientes dos condiciones:

(a) La probabilidad de protonación (P) de cada aminoácido individual en la secuencia proteínica (definida por el pKa de cada aminoácido individual) está lo más lejos posible de 50% (es decir, 50% en forma protonada y 50% en forma desprotonada); y

(b) La protonación global de todos los aminoácidos en la secuencia proteínica (definida por los valores de pKa de todos los aminoácidos en la secuencia) es lo más alta posible.

El estado de equilibrio óptimo de intercambio de protones, es decir, el estado al cual la estabilidad durante la conservación está optimizada, el aquél en el que se cumplen ambas condiciones a) y b) tanto como sea posible, alcanzándose un compromiso entre las dos condiciones para una optimización global.

Los valores de los criterios en las condiciones a) y b) son ambos dependientes del pH, y pueden calcularse para cualquier proteína a cualquier pH. El cálculo de la condición a) necesita que se conozca la secuencia de aminoácidos de la proteína (esto puede basarse en todos los aminoácidos, pero está basado preferiblemente en sólo los aminoácidos accesibles en la superficie de la proteína, en estado plegado, activo) y los valores de pKa de la cadenas laterales de los aminoácidos de la proteína. Sólo los 7 aminoácidos protonables son de interés. El cálculo de la condición b) necesita también que se conozca el punto isoeléctrico de la proteína. De este modo, puede determinarse el pH al cual se cumplen tanto como sea posible ambas condiciones a) y b).

En particular, la probabilidad de protonación (P), a la que también se hace referencia en la presente invención como frecuencia de intercambio de protones, puede calcularse a cualquier pH como se ha descrito anteriormente, y representarse frente al pH para permitir la determinación del pH (en el intervalo de 4 a 9) al cual P está en un mínimo (Pmínimo).

La probabilidad de protonación (P) puede calcularse mediante la siguiente función matemática:

**(Ver fórmula)**

40

M es el peso molecular relativo de la unidad proteínica; N es el número de las cadenas laterales de aminoácidos dadas en la unidad proteínica; y pKa es el logaritmo negativo de la constante de disociación del ácido Ka de la cadena lateral de aminoácidos dada.

El ajuste para tener en cuenta la condición b) puede hacerse entonces calculando un valor optimizado de P (Poptimizado) mediante la siguiente ecuación:

**(Ver fórmula)**

en la que:

pI es el punto isoeléctrico de la proteína; y

A y B son constantes con los valores A = -1,192 y B = 10,587 si se usa la composición... [Seguir leyendo]

1. Un método para método para aumentar la estabilidad de una proteína en un sistema acuoso, que comprende:

(a) seleccionar un pH para la composición que está dentro de un intervalo de estabilidad de la proteína que es al menos 50% de la estabilidad máxima de la proteína con respecto al pH; y

(b) preparar una composición que comprende la proteína y dos agentes estabilizantes, caracterizada porque:

(i) los dos agentes estabilizantes tienen grupos ionizables capaces de intercambiar protones con la proteína y con los productos ionizados de la disociación del agua;

(ii) los grupos ionizables consisten en primeros grupos que están cargados positivamente cuando están protonados y sin carga cuando están desprotonados, y segundos grupos que están sin carga cuando están protonados y cargados negativamente cuando están desprotonados, en los que los primeros y segundos grupos tienen valores de pKa, respectivamente, de 1 a 5 unidades de pH superiores y de 1 a 5 unidades inferiores al pH de la composición;

y

(iii) el pH de la composición está dentro de un intervalo de estabilidad de la proteína que es al menos 50% de la estabilidad máxima de la proteína con respecto al pH.

2. Un método para aumentar la estabilidad de una proteína en un sistema acuoso, que comprende:

(a) seleccionar un pH para la composición que está dentro de un intervalo de ± 0,5 unidades de pH del pH al que la composición tiene una estabilidad máxima con respecto al pH; y

(b) preparar una composición que comprende la proteína y dos agentes estabilizantes, caracterizada porque:

(i) los dos agentes estabilizantes tienen grupos ionizables capaces de intercambiar protones con la proteína y con los productos ionizados de la disociación del agua;

(ii) los grupos ionizables consisten en primeros grupos que están cargados positivamente cuando están protonados y sin carga cuando están desprotonados, y segundos grupos que están sin carga cuando están protonados y cargados negativamente cuando están desprotonados, en los que los primeros y segundos grupos tienen valores de pKa, respectivamente, de 1 a 5 unidades de pH superiores y de 1 a 5 unidades inferiores al pH de la composición;

y

(iii) el pH de la composición está dentro de un intervalo de ± 0,5 unidades de pH del pH al que la composición tiene una estabilidad máxima con respecto al pH.

3. Un método conforme a la reivindicación 1, en el que dicho intervalo es al menos 60% de la estabilidad máxima.

4. Un método conforme a la reivindicación 1, en el que dicho intervalo es al menos 70% de la estabilidad máxima.

5. Un método conforme a la reivindicación 1, en el que dicho intervalo es al menos 80% de la estabilidad máxima.

6. Un método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los valores de pKa respectivos están cada uno dentro de 1 a 4 unidades de pH del pH de la composición.

7. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que al menos 80% del primer y segundo grupos ionizables están ionizados.

8. Un método conforme a la reivindicación 7, en el que el primer y segundo grupos ionizables están de manera sustancial completamente ionizados.

9. Un método conforme a la reivindicación 7 o reivindicación 8, en el que los valores de pKa respectivos están

cada uno dentro de 1 a 3 unidades de pH del pH de la composición. 10. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que el pH de la composición es de 4 a 9. 11. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que la composición comprende adicionalmente un polialcohol.

12. Un método conforme a la reivindicación 11, en el que la composición comprende al menos 0,5% (p/p) del

polialcohol. 13. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que la composición comprende al menos 0,1% (p/p) de los dos agentes estabilizantes.

14. Un método conforme a la reivindicación 13, en el que la composición comprende al menos 0,5% (p/p) de los

dos agentes estabilizantes. 15. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que la composición comprende hasta 200 mM de cada agente estabilizante.

16. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que la composición comprende hasta 100 mM de cada agente estabilizante.

17. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína está en estado natural. 18. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que la estabilidad de la proteína se determina en términos de su retención de sus características funcionales y/o estructurales.

19. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína es una hormona o factor

de crecimiento. 20. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína es una proteína terapéutica.

21. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína es un anticuerpo terapéutico. 22. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína es un interferón.

23. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína es inmunógena. 24. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el sistema acuoso es una disolución, suspensión o dispersión acuosa.

25. El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que un agente estabilizante

contiene los primeros grupos ionizables y el otro agente estabilizante contiene los segundos grupos ionizables. 26. El método conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que un agente estabilizante contiene tanto los primeros grupos ionizables como los segundos grupos ionizables.

27. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que el primer grupo ionizable es un grupo de amina.

28. Un método conforme a la reivindicación 27, en el que un agente estabilizante es TRIS. 29. Un método conforme a cualquier reivindicación precedente, en el que el segundo grupo ionizable es un grupo carboxílico.

30. Un método conforme a la reivindicación 29, en el que un agente estabilizante es un ácido carboxílico distinto a un aminoácido.