Formulación de una proteína.

Una composición acuosa terapéuticamente útil que comprende una proteína a un pH ajustado a un valor particular,

con la velocidad de dimerización o de formación de especies de alto peso molecular reducida a dicho pH, caracterizada porque la composición comprende un excipiente anfifílico que tiene una carga y una zona no polar y especies no iónicas para ajustar su osmolaridad y en donde la fuerza iónica de la composición es menor que 30 mM, siendo dicha fuerza iónica calculada usando la fórmula:**Fórmula**

en la que cx es la concentración molar de ion x (mol l-1), zx es el valor absoluto de la carga de ion x y la suma abarca todos los iones (n) presentes en la composición

Formulación de una proteína Campo de la invención Esta invención se refiere a la estabilidad de proteínas que muestran la formación de dímeros o de especies de mayor peso molecular. La invención se refiere además a la estabilidad de las proteínas en sistemas acuosos, por ejemplo en una solución acuosa, en forma de gel acuoso o en estado no líquido como en estado sólido donde está presente agua libre o enlazada, por ejemplo, en estado de congelación o después de la eliminación parcial de agua, tal como mediante secado o liofilización.

Antecedentes de la invención Muchas moléculas biológicas, tal como las proteínas, son inestables y son susceptibles a la degradación estructural y a la consiguiente pérdida de actividad mientras están almacenadas, en particular en soluciones acuosas. Los procesos involucrados en la degradación de las proteínas se pueden dividir en físicos (es decir, procesos basados en interacciones no covalentes, tal como la pérdida de la estructura cuaternaria, terciaria o secundaria, agregación, adsorción superficial) y químicos (es decir, procesos que implican un cambio covalente tal como desamidación, hidrólisis, oxidación, codificación del disulfuro, etc.) . Las velocidades de los procesos de degradación son típicamente proporcionales a la temperatura. Las proteínas son, por lo tanto, generalmente más estables a temperaturas más bajas. Los mismos principios de degradación se aplican generalmente a otras moléculas biológicas y sistemas supramoleculares más complejos formados por un número discreto de subunidades moleculares o componentes ensamblados.

Tanto la inestabilidad física como la química de las moléculas es un problema particular en muchas aplicaciones, tal como las aplicaciones destinadas a terapia.

Un problema particular de la estabilidad de las proteínas y otras moléculas biológicas, especialmente las utilizadas en terapia, es la formación de dímeros o de especies de mayor peso molecular (HMWS) , mediante las que dos o más moléculas se agregan y forman entidades de mayor peso molecular. Dicha agregación puede ser reversible o irreversible, dependiendo de la naturaleza de las interacciones entre las moléculas de proteínas. Un número de diferentes tipos de interacciones no covalentes se puede acoplar en la agregación de proteínas, tal como las interacciones iónicas entre partes cargadas positiva y negativamente de las moléculas de las proteínas, o las interacciones hidrófobas entre fragmentos hidrófobos en la superficie de la proteína. En casos raros, incluso las interacciones covalentes, tal como los enlaces de disulfuro pueden facilitar la agregación de las proteínas. Aunque los diferentes tipos de interacciones pueden combinarse, es típico que un tipo particular sea la fuerza dominante en el proceso de formación de HMWS. Así, por ejemplo, algunas proteínas pueden formar HMWS debido predominantemente a las interacciones iónicas, mientras que otras proteínas debido principalmente a las interacciones hidrófobas. Las condiciones que conducen a la formación de HMWS varían en adelante en función de las interacciones dominantes involucradas. En consecuencia, para minimizar la velocidad de formación de HMWS de diferentes proteínas pueden emplearse diferentes condiciones.

La formación de HMWS se puede medir mediante diversas técnicas tales como la cromatografía de exclusión por tamaño. La formación de grandes agregados se puede seguir mediante diversas técnicas de dispersión de la luz o de evaluación microscópica o visual.

La agregación es un problema particular en formulaciones de moléculas biológicas terapéuticas. Aunque las formas agregadas, especialmente si son reversibles, son a menudo equipotentes con la forma nativa de la proteína, la formación de HMWS representa un obstáculo considerable en el proceso de la aprobación según la normativa.

Otro problema de estabilidad particular de muchas clases diferentes de moléculas, que abarcan desde pequeñas moléculas hasta sistemas supramoleculares complejos, es la escisión de un enlace entre dos partes conjugadas de la molécula o del sistema. Ejemplos de tales procesos no deseables incluyen la escisión de un resto de polisacárido a partir de una proteína portadora en un número de vacunas basadas en polisacáridos (por ejemplo, la vacuna de Haemophillus influenzae b) o una escisión entre dominios clave de las proteínas de fusión (por ejemplo, Etanercept) . La hidrólisis ácida o básica es típicamente el mecanismo de tales procesos de degradación.

La hidrólisis es una reacción química durante la cual una molécula de agua se divide en iones hidrógeno e hidróxido que van a participar en la escisión de un enlace covalente particular. La hidrólisis requiere la presencia de agua y se sabe que es un proceso que depende del pH. Sin embargo, la transferencia del protón de las moléculas también puede estar involucrada en el mecanismo de la escisión hidrolítica.

El documento WO 2007/003936 describe un sistema acuoso que comprende una proteína y uno o más agentes estabilizantes, caracterizado porque (i) uno o más agentes estabilizantes tienen grupos ionizables capaces de intercambiar protones con la proteína y con los productos ionizados de la disociación del agua; (ii) los grupos

ionizables incluyen primeros grupos que están cargados positivamente cuando están protonados y sin carga cuando están desprotonados, y segundos grupos que están sin carga cuando están protonados y cargados negativamente cuando están desprotonados; y (iii) el pH de la composición está dentro de un intervalo de estabilidad de la proteína que es al menos 50% de la estabilidad máxima de la proteína con respecto al pH.

Compendio de la invención La presente invención se basa en el descubrimiento de varios parámetros deseables de formulaciones acuosas de moléculas pequeñas, macromoléculas tales como las proteínas y los sistemas supramoleculares. La aplicación de la invención da como resultado una mejora de la estabilidad, potencialmente sustancial, de tales moléculas o sistemas. En algunos aspectos, la aplicación de la invención da como resultado la reducción deseable de la formación de dímeros y HMWS durante el almacenamiento. En otros aspectos, la aplicación de la invención da como resultado una reducción deseable de la velocidad de los procesos hidrolíticos desestabilizadores.

Según la invención, se proporciona una composición acuosa terapéuticamente útil que comprende una proteína a un pH ajustado a un valor particular, con la velocidad de dimerización o de formación de especies de alto peso molecular reducida a dicho pH, caracterizada porque la composición comprende un excipiente anfifílico que tiene una carga y una zona no polar y especies no iónicas para ajustar su osmolaridad y en donde la fuerza iónica de la composición es menor que 30 mM, siendo dicha fuerza iónica calculada usando la fórmula:

** (Ver fórmula) **

en la que cx es la concentración molar de ion x (mol l-1) , zx es el valor absoluto de la carga de ion x y la suma abarca todos los iones (n) presentes en la composición.

Descripción de la invención La expresión "molécula pequeña" se utiliza aquí para abarcar una molécula de cualquier estructura química con un peso molecular entre 50-2.000 Da.

El término "macromolécula" se utiliza aquí para abarcar una molécula de cualquier estructura química con un peso molecular mayor que 2.000 Da. Las macromoléculas serán típicamente de naturaleza polimérica, pero la invención no se limita a las macromoléculas poliméricas.

El término "proteína" se utiliza aquí para abarcar moléculas o complejos moleculares que consisten en un único polipéptido, moléculas o complejos moleculares que comprenden dos o más polipéptidos y moléculas o complejos moleculares que comprenden uno o más polipéptidos junto con uno o más restos no polipeptídicos, tales como grupos prostéticos, cofactores, etc. El término "polipéptido" pretende abarcar polipéptidos que comprenden restos no aminoácidos enlazados de forma covalente, tales como polipéptidos glicosilados, lipoproteínas, etc.

La expresión "sistemas supramoleculares" se utiliza aquí para abarcar cualquier sistema compuesto por un número discreto de subunidades moleculares o componentes ensamblados.

La expresión "sustancia utilizada en terapia" se utiliza aquí para abarcar cualquier sustancia que se desarrolla con la 45 intención de ser utilizada en pruebas clínicas o para ser aprobadas como parte de un dispositivo médico o como un producto farmacéutico.

La expresión "especies de alto peso molecular" se utiliza aquí para abarcar cualquier especie formada por la agregación... [Seguir leyendo]

1. Una composición acuosa terapéuticamente útil que comprende una proteína a un pH ajustado a un valor particular, con la velocidad de dimerización o de formación de especies de alto peso molecular reducida a dicho pH, caracterizada porque la composición comprende un excipiente anfifílico que tiene una carga y una zona no polar y especies no iónicas para ajustar su osmolaridad y en donde la fuerza iónica de la composición es menor que 30 mM, siendo dicha fuerza iónica calculada usando la fórmula:

** (Ver fórmula) **

en la que cx es la concentración molar de ion x (mol l-1) , zx es el valor absoluto de la carga de ion x y la suma abarca todos los iones (n) presentes en la composición.

2. Una composición según la reivindicación 1, en donde la fuerza iónica es menor que 15 mM. 15

3. Una composición según la reivindicación 1, en donde la fuerza iónica es menor que 10 mM.

4. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que está sustancialmente exenta de iones

divalentes. 20

5. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la zona no polar es un núcleo de benceno.

6. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la zona no polar es una cadena 25 alifática de al menos cuatro carbonos.

7. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el excipiente anfifílico es ácido benzoico.

8. Una composición según cualquier reivindicación precedente, en donde la proteína es una vacuna.

9. Una composición según cualquier reivindicación precedente, en donde las especies no iónicas para ajustar la osmolaridad son azúcares o alcoholes de azúcares.

10. Una composición según cualquier reivindicación precedente, que comprende además un agente quelante fisiológicamente aceptable.

11. Una composición según cualquier reivindicación precedente, que comprende además un detergente fisiológicamente aceptable. 40

12. Uso de una composición acuosa que comprende un excipiente anfifílico que tiene una carga y una zona no polar y especies no iónicas para ajustar su osmolaridad y en donde la fuerza iónica de la composición es menor que 30 mM, siendo dicha fuerza iónica calculada usando la fórmula:

** (Ver fórmula) **

en la que cx es la concentración molar de ion x (mol l-1) , zx es el valor absoluto de la carga de ion x y la suma abarca todos los iones (n) presentes en la composición, para reducir la velocidad de dimerización o de formación de especies de elevado peso molecular de una proteína 50 terapéuticamente útil a un pH ajustado a un valor particular.

13. Uso según la reivindicación 12, en donde la zona no polar es un núcleo de benceno.

14. Uso según la reivindicación 12, en donde el excipiente anfifílico es ácido benzoico. 55

15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde la proteína es una vacuna.