Empleo de un material de sílice en una reacción de amplificación.

Un método para la purificación y amplificación de un ácido nucleico diana a partir de una muestra biológica que contiene dicho ácido nucleico diana,

el cual método comprende los pasos de: a) adición de un material que contiene partículas de vidrio magnéticas con una superficie de sílice sin modificar, a dicha muestra para unir dicho ácido nucleico diana a dicho material, b) separación de dicho material de dicha muestra, c) elución de dicho ácido nucleico diana de dicho material, y d) amplificación de dicho ácido nucleico diana en presencia de dicho material, en donde dichas partículas de vidrio magnéticas se obtienen por el método de sol-gel.

Empleo de un material de sílice en una reacción de amplificación

Fundamentos de la invención 5

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método para el aislamiento de ácidos nucleicos empleando un material con una superficie de sílice sin modificar, tal como partículas de vidrio magnéticas, y subsiguiente amplificación de un ácido 10 nucleico diana en presencia del material con una superficie de sílice sin modificar. El método se efectúa de preferencia como un proceso automatizado, de preferencia en un formato de alto rendimiento. El método se emplea de preferencia en diagnósticos.

Antecedentes 15

Muchas substancias biológicas, especialmente los ácidos nucleicos, presentan problemas importantes en el sentido de su aislamiento de su entorno natural. Por una parte, están a menudo presentes en muy poca concentración, y por otra parte, se encuentran a menudo en presencia de muchas otras substancias sólidas y disueltas, p. ej., después de la lisis de las células. Esto dificulta su aislamiento o su medición, en particular en ensayos bioespecíficos que 20 permiten la detección de analitos específicos, p. ej., ácidos nucleicos o propiedades específicas de analitos y juega un papel importante en el campo de los diagnósticos y bioanalítica en investigación y desarrollo.

Antes de que una substancia o compuesto biológico, por ejemplo, un ácido nucleico, pueda ser analizado en un ensayo bioespecífico o empleado para otros procesos, a menudo debe ser aislado o purificado a partir de muestras 25 biológicas que contienen mezclas complejas de diferentes componentes como p. ej., componentes proteínicos y no proteínicos. Frecuentemente, la substancia biológica está contenida en una célula bacteriana, una célula de un hongo, una partícula vírica, o la célula de un organismo más complejo, tal como una célula de sangre humana o una célula vegetal. La substancia biológica para analizar recibe con frecuencia también el nombre de substancia de interés o substancia diana. Frecuentemente, la substancia diana es un ácido nucleico, el cual en consecuencia, 30 recibe el nombre de ácido nucleico diana.

Para liberar el contenido de dichas células o partículas, puede ser tratado con enzimas o con productos químicos para disolver, degradar o desnaturalizar las paredes de las células y/o las membranas de las células. Este proceso se conoce habitualmente con el nombre de lisis. La solución resultante que contiene dicho material lisado se conoce 35 con el nombre de lisado. Un problema que a menudo aparece durante la lisis es que las enzimas que degradan la substancia de interés, p. ej., las desoxirribonucleasas o ribonucleasas, que degradan los ácidos nucleicos, entran en contacto con la substancia de interés durante la lisis. Estas enzimas de degradación pueden estar presentes fuera de las células o pueden haber sido separadas espacialmente en diferentes compartimentos celulares antes de la lisis. Otros componentes liberados durante este proceso pueden incluir por ejemplo, endotoxinas pertenecientes a la 40 familia de los lipopolisacáridos las cuales son tóxicas para las células y pueden causar problemas en el caso de productos que se pretende utilizar en la terapia humana o animal. Existen una variedad de medios para abordar este citado problema. Es corriente emplear agentes caotrópicos como p. ej., las sales de guanidinio o detergentes aniónicos, catiónicos, biónicos o no iónicos cuando se proyecta que los ácido nucleicos estén libres. Es también una ventaja, el empleo de proteasas, p. ej., la proteinasa K, la cual degrada rápidamente estas enzimas o proteínas no 45 deseadas. Sin embargo, esto puede producir otro problema, a saber, que dichas substancias o enzimas puedan interferir con reactivos o componentes en pasos subsiguientes.

Si las substancias de interés son ácidos nucleicos, normalmente se extraen, y de esta forma se separan de las mezclas complejas de la lisis antes de ser utilizados en un ensayo. Existen varios métodos para la extracción de 50 ácidos nucleicos como los métodos dependientes de la secuencia o métodos bioespecíficos (cromatografía de afinidad, hibridación a sondas inmovilizadas) o los métodos independientes de la secuencia o métodos físico-químicos (extracción líquido-líquido con p. ej., fenol-cloroformo, precipitación con p. ej., etanol puro, extracción con papel de filtro, extracción con agentes formadores de micelas como el bromuro de cetil-trimetil-amonio, unión a colorantes intercalados, inmovilizados, p. ej., derivados de acridina, adsorción a silica gel o tierras de diatomeas, 55 adsorción a partículas de vidrio magnéticas (MGPs) ó partículas de organosilanos en condiciones caotrópicas. La extracción empleando fases sólidas comprende habitualmente los pasos de adición del lisado a la fase sólida en condiciones que permiten la unión de la substancia de interés a la fase sólida, eliminación del resto de lisado de la substancia unida a la fase sólida y subsiguiente liberación de la substancia de interés de la fase sólida en un eluato líquido (algunas veces llamado también elución) . El resultado del proceso de extracción es habitualmente una 60 solución que contiene la substancia de interés en estado disuelto. Particularmente interesante para la finalidad de la extracción es la adsorción del ácido nucleico a una superficie de vidrio, en particular las superficies de vidrio MGP. En los últimos años, han sido propuestos muchos procedimientos para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de su entorno natural, mediante el empleo de su comportamiento de unión a las superficies de vidrio.

Después del paso de extracción, la solución que contiene la substancia de interés, p. ej., el ácido nucleico, se analiza mediante un ensayo bioespecífico para ver si la substancia de interés está presente en la muestra original. Ejemplos de ensayos bioespecíficos son los ensayos de hibridación para ácidos nucleicos, inmunoensayos o ensayos de receptor-ligando para proteínas. Los ensayos de hibridación emplean el emparejamiento específico de las bases para la detección molecular de analitos de ácido nucleico, por ejemplo, ARN ó ADN. Así por ejemplo, 5 sondas de oligonucleótidos con una secuencia de una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 20 nucleótidos pueden permitir el reconocimiento específico de una secuencia complementaria seleccionada, por ejemplo, en el genoma humano. Otro ensayo que supone la unión selectiva de dos cebadores oligonucleótidos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita en la patente US 4.683.195. Este método permite la amplificación selectiva de una región específica de ácido nucleico hasta niveles detectables mediante una 10 polimerasa termoestable en presencia de desoxidonucleótido trifosfatos en varios ciclos. A continuación, el ácido nucleico se detecta mediante métodos ya conocidos por el experto en la técnica. Otros métodos, como el ensayo TaqMan® descrito en la patente WO92/02638, permite simultáneamente la amplificación y detección de un ácido nucleico de interés.

Normalmente, los pasos de lisis, extracción y amplificación se realizan consecutivamente, mientras se efectúan una variedad de diferentes operaciones, p. ej., la eliminación de fases que contienen solamente proteína, la elución de los ácidos nucleicos a partir del soporte empleado para la extracción y eliminación del soporte, la transferencia de líquidos a tubos frescos, etc. Son necesarios nuevos métodos de preparación de muestras de ácido nucleico para mejorar la eficiencia y/o sensibilidad de por ejemplo, métodos de detección del ácido nucleico. 20

La patente EP 0389063 describe un procedimiento para el aislamiento del ácido nucleico mezclando un material de partida biológico complejo, una substancia caotrópica y una fase sólida de unión al ácido nucleico que comprende sílice, separando la fase sólida con su ácido nucleico unido a la misma, lavando el ácido nucleico unido a la fase sólida y eluyendo el ácido nucleico a partir de la fase sólida. 25

La patente WO 96/18731 proporciona un método de aislamiento del ácido nucleico a partir de una muestra, en donde el método comprende la puesta en contacto de la muestra con un detergente y un soporte sólido.

La patente WO/99/39010 describe un reactivo de elución del ADN que comprende un tampón, una base, un agente 30 quelante, y agua.

La patente WO 01/14590 divulga métodos para aislar una cantidad de un material de ADN diana a partir de otro material en un medio 35

La patente WO 99/16781 divulga un método para preparar muestras biológicas para la detección posterior de un analito, especialmente un ácido nucleico, en dicha muestra....

1. Un método para la purificación y amplificación de un ácido nucleico diana a partir de una muestra biológica que contiene dicho ácido nucleico diana, el cual método comprende los pasos de:

a) adición de un material que contiene partículas de vidrio magnéticas con una superficie de sílice sin modificar, a dicha muestra para unir dicho ácido nucleico diana a dicho material,

b) separación de dicho material de dicha muestra,

c) elución de dicho ácido nucleico diana de dicho material, y

d) amplificación de dicho ácido nucleico diana en presencia de dicho material, 10

en donde directamente después de la etapa c)

(i) dichos ácido nucleico diana, ácidos nucleicos no dianas y dicho material se transfieren a un tubo de reacción que contiene todos los reactivos necesarios para la amplificación o (ii) todos los reactivos necesarios para la amplificación se añaden a dichos ácido ácido nucleico diana, ácidos 15 nucleicos no diana y dicho material,

en donde dichas partículas de vidrio magnéticas se fabrican mediante el método de sol-gel que comprende suspender objetos magnéticos en un sol, hidrolizar el sol para cubrir los objetos magnéticos con un gel, secar por pulverización los objetos magnéticos cubiertos con un gel en un sistema de secado por pulverización y sinterizar el 20 polvo secado por pulverización para formar un vidrio a partir del gel que cubre a los objetos magnéticos.

2. Método para la amplificación de un ácido nucleico diana en una muestra, el cual método comprende los pasos de:

(a) adición de un material que contiene partículas de vidrio magnéticas con una superficie de sílice sin modificar, 25 a dicha muestra,

(b) separación de dicho material de dicha muestra,

(c) elución de dicho ácido nucleico diana a partir de dicho material, y

(d) amplificación de dicho ácido nucleico diana en presencia de dicho material,

en donde directamente después de la etapa c) 30

(i) dichos ácido nucleico diana, ácidos nucleicos no dianas y dicho material se transfieren a un tubo de reacción que contiene todos los reactivos necesarios para la amplificación o (ii) todos los reactivos necesarios para la amplificación se añaden a dichos ácido ácido nucleico diana, ácidos nucleicos no diana y dicho material, 35

en donde dichas partículas de vidrio magnéticas se fabrican mediante el método de sol-gel que comprende suspender objetos magnéticos en un sol, hidrolizar el sol para cubrir los objetos magnéticos con un gel, secar por pulverización los objetos magnéticos cubiertos con un gel en un sistema de secado por pulverización y sinterizar el polvo secado por pulverización para formar un vidrio a partir del gel que cubre a los objetos magnéticos. 40

3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico diana es ARN ó ADN.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho paso de amplificación se efectúa empleando una reacción en cadena de la polimerasa. 45

5. El método de la reivindicación 1, en donde dicho material que tiene una superficie de sílice sin modificar, está presente mientras se efectúa la amplificación del ácido nucleico diana y mientras se efectúa la detección del ácido nucleico diana.

6. El método de la reivindicación 5, en donde dicho ácido nucleico diana amplificado es detectado durante dicha amplificación.

7. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método de sol-gel comprende los pasos de:

(a) suspensión de cuerpos magnéticos en un sol,

(b) hidrólisis del sol para recubrir los cuerpos magnéticos con un gel,

(c) secado por pulverización de los cuerpos magnéticos recubiertos con un gel en un secador de pulverización de dos toberas, y

(d) sinterización del polvo secado por pulverización para formar un vidrio a partir del gel que recubre los cuerpos 60 magnéticos.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la temperatura de entrada del secador de pulverización de dos toberas, es entre 120ºC y 500ºC, la temperatura de salida se escoge de acuerdo con el punto de ebullición del sol, y la presión de pulverización está entre 4 y 6 bars. 65

9. El método de la reivindicación 8, en donde el período de semivida para la sedimentación de una suspensión de 3 mg/litro peso-por-volumen de las partículas de vidrio magnéticas en isopropanol, es mayor de 6 minutos.

10. El método de la reivindicación 8, en donde las partículas de vidrio magnéticas tienen un diámetro medio entre 0, 5 µm y 5 µm. 5

11. El método de la reivindicación 8, en donde las partículas de vidrio magnéticas con una superficie de vidrio sin modificar contienen un cuerpo magnético con un diámetro entre 5 y 500 nm.

12. El método de la reivindicación 8, en donde las partículas de vidrio magnéticas con una superficie de vidrio sin 10 modificar contienen un cuerpo magnético con un diámetro medio de 23 nm.