Procedimiento para el aislamiento específico del contenido de ADN total de gérmenes bacterianos y un kit para dicho fin.

Procedimiento para el aislamiento específico de contenido en ADN total de gérmenes bacterianos de muestras,

en el curso del cual se lisan las células, el contenido en ADN del lisado se une selectivamente, se lava y después el ácido nucleico de polímeros lineales desalinizados se eluye a partir de la superficie de unión en una solución acuosa, caracterizado porque de forma preliminar las células bacterianas no viables se separan de las células viables en base a sus características fisicoquímicas de superficie celular diferentes como resultado de lo cual exclusivamente el ADN de cadena doble que deriva del lisado de células viables está unido sobre una -SiO2-TiO2-matriz que contiene grupos -OH y dodecilamina químicamente activados.

Procedimiento para el aislamiento específico del contenido de ADN total de gérmenes bacterianos y un kit para dicho fin

El sujeto de la presente invención es un procedimiento para el aislamiento específico del contenido de ADN total de gérmenes de muestras de orígenes diferentes y un KIT para la realización del procedimiento en la práctica.

En el control higiénico de la salud pública de aguas potables, aguas ambientales, productos alimenticios, áreas de trabajo, diferentes superficies comunales y ambientales una parte esencial de las pruebas microbiológicas de muestras recogidas es la determinación cualitativa y cuantitativa de gérmenes bacterianos. Para tales determinaciones -además del cultivo in vitro en medios selectivos o no selectivos y de la detección microscópica de ellos y además de las reacciones bioquímicas elaboradas por etapas metabólicas bacterianas individuales- ahora están disponibles también varios procedimientos diagnósticos moleculares basados en ácidos nucleicos, tales como por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la amplificación in vitro de secuencias de ácidos nucleicos, o el procedimiento de secuenciación revelando secuencia de bases de ácidos nucleicos, o electroforesis en gel de agarosa que analiza el tamaño de fragmentos de ácidos nucleicos obtenidos [Nucleic Acid Isolation and Purificaron, 2" edición, Roche Diagnostics GmbH, 2003]. A diferencia de las técnicas tradicionales, estos procedimientos diagnósticos moleculares basados en ácidos nucleicos permiten análisis incluso en el caso de una cantidad pequeña de muestras iniciales. La plantilla de estos procedimientos diagnósticos moleculares basados en ácidos nucleicos es el ácido nucleico bacteriano en una concentración y pureza requerida por el procedimiento analítico actual en uso. Sin embargo, estos dos parámetros, la concentración de ácidos nucleicos y la pureza varían con los procedimientos preanalíticos aplicados, es decir con los procedimientos de alteración de muestra y de extracción de ácidos nucleicos. La alteración de muestra para acceder a los ácidos nucleicos de plantilla es un procedimiento multietapa, durante el que el uso actual que satisface las etapas individuales puede tener lugar por separado o combinado con cada uno de los otros. Tradicionalmente la alteración comienza con lisis celular, seguida por la unión-extracción y purificación selectivas del ácido desoxirribonucleico (ADN) en las siguientes etapas y después el procedimiento finaliza con la determinación cualitativa y cualitativa del ácido nucleico aislado purificado. La alteración puede tener lugar asegurando el pH, la temperatura y las condiciones iónicas adecuados, mecánicamente (por ejemplo por hinchazón, disgregación por ultrasonidos, alteración por triturado), químicamente (por ejemplo con un tampón que contiene enzimas, tensioactivos, detergentes quelantes de iones), en un compuesto combinado de desnaturalizador proteico y aditivos que inhiben las desoxirribonucleasas intracelulares. A partir del lisado obtenido por alteración, el ácido nucleico objetivo puede aislarse y purificarse con la ayuda de precipitación-extracción, centrifugación, electroforesis o cromatografía. El análisis semicuantitativo del rendimiento de ácidos nucleicos purificados a partir de macromoléculas y fragmentos celulares adicionales puede tener lugar por ejemplo midiendo la emisión fluorescente de ADN intercalando tinción poliaromática (por ejemplo bromuro de etidio) inducida a longitud de onda ultravioleta (UV). El análisis cuantitativo del análisis de ácidos nucleicos aislados se puede llevar a cabo en base a la densidad óptica (D O.) medida a longitud de onda A260 con espectrometría de luz ultravioleta. Una unidad de D O. corresponde a 50 pg/ml de concentración de ADN. Con el fin de definir la pureza del ADN aislado.se usa la proporción de la densidad óptica medida a dos longitudes de onda de UV diferentes (D.O.260/D.O.280), que es la proporción de absorción lumínica medida a la longitud de onda característica de la solución acuosa de los ácidos nucleicos y la solución acuosa de las proteínas (Á26oyÁ2so). De forma favorable el valor de la proporción de D.O.260/D.O.280 varía en el intervalo entre 1,4-2,0. Valores inferiores indican contaminación proteica (por ejemplo componentes proteicos residuales del lisado celular), mientras que valores más altos (>2) indican errores de medidas espectrofotométricas u otras posibilidades de contaminación. Cuando se usa PCR, favorablemente la proporción D.O.260/D.O.280 debe estar entre 1,4-1,8.

En la práctica de salud pública de cada día tradicional, la mayoría del ADN bacteriano comúnmente se aísla usando la mezcla de fenol-cloroformo [Sambrook J. et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 3" edición 2001]. El procedimiento está basado en que las células se alteran con tampones de lisis que contienen detergentes, enzimas que degradan proteínas, después se añade mezcla de fenol-cloroformo al lisado, como resultado de lo que la fase de fenol ácida extrae entre otros los componentes proteicos y de ARN del lisado [Cohn E.J., Conant J.B.(1926): PNAS 12: 433-438] y el ADN se puede aislar con un disolvente orgánico miscible con agua, por ejemplo con ¡sopropanol [Kirby K.S.(1956): Biochem.J. 64: 405-408].

Los disolventes orgánicos mencionados anteriormente son indudablemente eficientes en el procedimiento de alteración y aislamiento, pero su efecto tóxico potencial que amenaza al personal de laboratorio y al ambiente no se puede despreciar. Una solución bastante común en evitar el uso de disolventes orgánicos mencionados anteriormente es cuando después de alterar muestras biológicas se añade también un componente caotrópico [Chomczynski P. et al.(1997): Biotechniques 22: 550-553 ] al sistema de tampón aislando el contenido de ADN genómico. Debido al componente caotrópico que desnaturaliza proteínas (por ejemplo NaJ, KJ, Na-perclorato, clorhidrato de guanidio, -GC, guanidio, tiocianato -GTC) y al nivel de pH apropiado las proteínas asociadas a ácidos nucleicos se disocian y la inhibición funcional de nucleasas que degradan ácidos nucleicos facilita aislamiento de ADN eficiente. La Patente de los EE UU. 4900677 describe un procedimiento adecuado para la alteración tanto de bacterias Gram negativas como de bacterias Gram positivas, después de lo que el contenido en ADN cromosómico de Pseudomonas aeruginosa y Streptococcus faecalis se aísla, entre otros, en un procedimiento rápido usando una solución libre de disolventes orgánicos. Con el fin de extraer ADN cromosómico, la masa celular de 10^-10^ inicial se altera en un cóctel basado en tampón de Tris de pH = 8,0 que contiene enzimas con espectros de objetivos diferentes (lisozima,

endo-N-acet¡l-muram¡n¡dasa, acromopeptidasa, etc.), componentes solubilizantes (por ejemplo dlmetllsulfóxido, dlmetilformamida), componentes tensloactivos (por ejemplo dodecllsulfato de sodio, Tritón X-100, CHAPS, CHAPSO) y componentes quelantes de Iones (por ejemplo EDTA), mezclando con agitador vortlclal. El contenido de ácido ribonucleico (ARN) contaminante se digiere con enzima rlbonucleasa (ARNasa) y el contenido de proteínas enzlmátlcas y no enzlmátlcas residual se neutraliza añadiendo Protelnasa K. Un componente caotróplco (por ejemplo: Na-trlfluoroacetato, Na-perclorato, NaJ) que respalda el aislamiento de ADN se añade al sistema y el ADN obtenido en casi una hora se purifica usando diálisis de membrana de colodión. La alteración de muestras y la neutralización de proteínas residuales se respaldan adlclonalmente con temperaturas de reacción que varían (37 °C y 60 °C). De acuerdo con la Patente de los EE UU. N.°: 5595876 la neutralización de proteínas residuales se respalda también Incrementando la temperatura, en el curso de la así llamada extracción de ADN de tubo Individual ¡n sltu de bacterias Gram negativas y Gram positivas.

Evitar el uso de disolventes orgánicos en el procedimiento de alteración y aislamiento como se describe anteriormente es exitoso, pero el rendimiento de la extracción y la pureza del ADN aislado se reducen.

Incrementar el rendimiento de ADN se Intenta por un enfoque Intermedio, que respalda el aislamiento selectivo de ADN añadiendo una cantidad pequeña de disolvente orgánico mlsclble con agua en un medio de tampón alcalino (por ejemplo: pH = 8-9). En la Patente de los EE.UU. 5945515, en uno de los ejemplos de eucarlotas, a partir del sistema que lisa que contiene también un componente caotróplco (GTC) en tampón alcalino el contenido de ARN se hace precipitar de manera preliminar añadiendo una cantidad pequeña de disolvente orgánico, después el precipitado se separa por centrifugación y por esto el ADN... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el aislamiento específico de contenido en ADN total de gérmenes bacterianos de muestras, en el curso del cual se lisan las células, el contenido en ADN del lisado se une selectivamente, se lava y después el ácido nucleico de polímeros lineales desalineados se eluye a partir de la superficie de unión en una solución acuosa, caracterizado porque de forma preliminar las células bacterianas no viables se separan de las células viables en base a sus características fisicoquímicas de superficie celular diferentes como resultado de lo cual exclusivamente el ADN de cadena doble que deriva del lisado de células viables está unido sobre una -SiCh-TiCh-matuz que contiene grupos -OH y dodecilamina químicamente activados.

2. Procedimiento como en la reivindicación 1, caracterizado porque las células bacterianas no viables son separadas de las células viables en base a su permeabilidad y afinidad iónica de superficie celular diferentes, usando una solución de lavado que penetra diferencialmente que contiene detergente, electrolito, favorablemente una mezcla tamponada de Tritón X-100, ácido etilendiaminatetraacético, KCI o NaCI, ácido cítrico-1-hidrato y se cambia la fuerza de campo de centrifugación que influye en la sedimentación de células.

3. Procedimiento como en la reivindicación 2, caracterizado porque la lisis de las células bacterianas viables es llevada a cabo con alteración mecánica respaldada con el uso de dispositivos de mesa o alteración mecánica y enzimàtica combinadas, favorablemente digestión de lisozima, en tubos de destrucción preparados individualmente.

4. Procedimiento como en la reivindicación 3, caracterizado porque el contenido de ADN de doble cadena de al menos muestra bacteriana de 10" U.F.C./ml es aislado con un tampón de lisis que contiene un componente rédox, agente quelante y detergentes, favorablemente ditiotreitol (DTT), ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), Tritón X-100 y dodecilsulfato sódico (SDS) y que agentes colorantes posibles que derivan de las células bacterianas viables e inhibidores de PCR (porfirinas, compuestos de hemo, materiales poliaromáticos) se separan durante la sedimentación del lisado bacteriano y la unión selectiva libre de degradación de los ADN de cadena doble que derivan del lisado de células bacterianas viables se lleva a cabo en una -Si02-T¡02-matriz, que contiene grupos -OH y dodecilamina activados y se ha reticulado preliminarmente con engarces de dodecilamina y en el que vínculos secundarios no específicos de matriz, prácticamente los vínculos a ARN, proteínas y otras macromoléculas, son bloqueados añadiendo trehalosa o dextrano y BSA.

5. Procedimiento como en la reivindicación 4, caracterizado porque la cantidad y pureza del ADN de cadena doble aislado se comprueba con un espectrofotómetro UV a una longitud de onda de 260 nm y la cantidad y pureza del ADN de cadena doble aislado se comprueba también con un espectrofotómetro UV a una longitud de onda de 280 nm y se comparan los valores de extinción de D.O.260 y D.O.280.

6. Uso de un KIT adecuado para aislar contenido de ADN total de gérmenes bacterianos, para la realización de la reivindicación 1, caracterizado porque ello contiene una Si02-T¡02-matriz que contiene grupos -OH y dodecilamina químicamente activados para analizar agua, comida, superficies comunales diferentes y muestras de salud pública.