Diana diagnóstica y terapéutica para enfermedades autoinmunitarias y sus usos.

Un fragmento de ZnT8 que consiste en un fragmento representado por una cualquiera de las SEC ID Nº:

9, 10, 14-18, 22, 23, 49-51 o 53-65, en donde el fragmento comprende la secuencia de aminoácidos SLTIQMES (posiciones 346-353 de la SEC ID Nº: 2) y la posición 325 de la SEC ID Nº: 2.

Diana diagnóstica y terapéutica para enfermedades autoinmunitarias y sus usos Referencia cruzada con solicitudes relacionadas La presente solicitud incorpora por referencia la descripción completa de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/882.815, presentada el 29 de diciembre de 2006.

Campo de la invención La presente invención se refiere en general a la identificación de dianas autoantigénicas, y particularmente, a dianas autoantigénicas en la diabetes autoinmunitaria de tipo I (DT1) , y más particularmente, a la proteína ZnT8 como un nuevo autoantígeno, sobre el que se basan las herramientas y métodos terapéuticos, diagnósticos y pronósticos y que se describen en el presente documento.

Antecedentes de la invención Los trastornos autoinmunitarios son afecciones causadas por una respuesta inmunitaria contra los tejidos propios del organismo. Los trastornos autoinmunitarios producen la destrucción de uno o más tipos de tejidos corporales, el crecimiento anómalo de un órgano, o cambios en la función orgánica. El trastorno puede afectar solo a un tipo de órgano o tejido o puede afectar a órganos y tejidos múltiples.

La diabetes autoinmunitaria de tipo 1 (DT1) en seres humanos y en el modelo de ratón NOD es una enfermedad autoinmunitaria poligénica dependiente de células T, caracterizada por la destrucción selectiva de las células B de los islotes de Langerhans (1-3) que proviene de una interrupción en la tolerancia contra antígenos de células B (4) en individuos susceptibles que tienen defectos intrínsecos en mecanismos inmunomoduladores críticos (5) (por ejemplo, individuos que exhiben una respuesta patógena en lugar de inmunoprotectora contra sí mismos) . Las células pancreáticas exocrinas y endocrinas, que comparten el mismo linaje evolutivo que el de las células B y que a menudo están en contacto directo con células B, no están en su mayor parte afectadas, y la insulitis se resuelve una vez que se pierden las células B, lo que sugiere que las dianas autoinmunitarias son principalmente específicas de células B. Muchos de los autoantígenos conocidos en la diabetes, tales como la insulina y la IGRP (proteína relacionada con la glucosa 6-fosfatasa específica de los islotes) , reflejan esta especificidad celular, sin embargo, la lista de dianas inmunitarias conocidas es en absoluto exhaustiva. Esto se aplica especialmente a los antígenos reconocidos por el brazo celular del sistema inmunitario, y las dianas de la mayoría de las células T CD4+ diabetogénicas siguen siendo insuficientes a pesar de más de una década de investigación. En los últimos años han aparecido unas cuantas dianas nuevas usando los procedimientos de exploración inmunológicos que originalmente identificaron moléculas tales como GAD65, IA-2 e ICA 69.

Muchos individuos con una fuerte predisposición genética a la DT1 nunca desarrollan enfermedad aparente (el 50 % de gemelos monocigotos con un miembro diabético sigue siendo discordante) y factores codificados por líneas no germinales influyen significativamente en la velocidad de progresión de la DT1 (7) . Esta baja penetrancia e historial natural variable apuntan a la importancia de factores ambientales, y también a la naturaleza estocástica del propio sistema inmunitario. Las estrategias terapéuticas que desplazan este equilibrio hacia un entorno más toleragénico tienen la posibilidad de prevenir o reducir la progresión de la autoinmunidad a insulinitis destructora.

Parece haber un número limitado de clones de células T reactivas en células de los islotes en infiltrados pancreáticos previos en ratones NOD (16; 17) y la progresión de la enfermedad parece implicar la propagación epitópica y (18) la maduración por avidez con respuestas previas de células T (19) junto con el reclutamiento de nuevos autoantígenos (20) . Numerosos clones de células T CD4+ y CD8+ específicas de los islotes se han aislado de infiltrados de bazo, ganglios linfáticos o islotes de ratones NOD pre-diabéticos o recientemente diabéticos (21-25) cuyos antígenos afines están mal definidos y no parecen corresponderse con ninguno de los marcadores serológicos de autoinmunidad de la diabetes conocidos en seres humanos, tales como GAD65, las proteínas de membrana de gránulos de insulina ICA512 (IA-2) y fogrina (IA-2B) (20) , carboxipeptidasa E (26) , ICA69 (27) y glucolípidos sulfatados (28) . Las dianas moleculares de células T autorreactivas pueden incluir bien un componente no identificado de células B, o proteínas de células B conocidas que son intrínsecamente incapaces de suscitar una respuesta humoral. Por consiguiente, la definición de antígenos afines para estos continúa siendo un objetivo importante, y con los recientes avances en las técnicas genómicas y proteómicas, aparece ahora una finalidad realista. Por tanto la diana del clon NY8.3 CD8+ bien estudiado (23) mostró recientemente ser un péptido derivado de la proteína de células B IGRP (proteína relacionada con la glucosa 6-fosfatasa específica de los islotes) usando una combinación de un bioensayo sensible y análisis de péptidos proteómicos eluidos de moléculas H-2Kd de células de insulinoma NIT1 (29) .

Aunque de por sí la respuesta tumoral contribuye probablemente poco a la patogénesis de la enfermedad (30) , la identificación de las dianas moleculares de linfocitos B es también el objetivo importante, dado que en la DT1 las células B desempeñan una función en la presentación antigénica (31) . Además, los anticuerpos circulantes

proporcionan marcadores preclínicos útiles para la autoinmunidad diabética. La producción de anticuerpos de alta afinidad es un proceso dependiente de linfocitos T y por tanto es razonable esperar que las moléculas reconocidas por autoanticuerpos deban ser también las dianas de linfocitos T diabetogénicos autorreactivos. Esta hipótesis parece correcta, al menos para la insulina, fogrina y GAD65 (32-34) . La lista de dianas conocidas, aunque larga, está lejos de ser exhaustiva. Esto se pone de manifiesto por el hecho de que el diagnóstico serológico de la pre-DT1 determinada por inmunohistoquímica del páncreas humano es aún el índice más sensible, simplemente porque define dianas adicionales que no están entre los autoantígenos definidos en términos moleculares.

Hay un continuo debate sobre si en la DT1, y en otras enfermedades autoinmunitarias, hay autoantígenos primaros o iniciadores. Para la DT1, el mejor candidato en el ratón NOD es actualmente la insulina (33; 35-38) aunque también se ha propuesto que la IGRP puede desempeñar este papel crucial (29; 39; 40) basándose en la frecuencia de células T precursoras que reconocen este antígeno en infiltrados de los islotes. Una vista alternativa es que la enfermedad sea resultado de la activación policlonal debido a una interrupción en los mecanismos toleragénicos normales que, de otra manera, generarían células reguladoras dirigidas contra las mismas moléculas (41) . Dada la última situación, los inventores llegaron a la hipótesis de que cualquier molécula que sea una diana de autoinmunidad significativa en la DT1 es un candidato para su uso en terapia basada en antígenos. Las estrategias de tolerización eficaces en ratones NOD basadas en inmunización con los epítopos nativos de insulina (42; 43) , GAD65 (44-48) , HSP 65 (49) e IGRP (50) parecen corroborar esto. Además, estudios preliminares realizados por los inventores con IA-2 y fogrina muestran que un epítopo peptídico conocido de ser humano y de ratón (péptido 7 (51) ) retrasa del mismo modo la aparición de la enfermedad cuando se administra neonatalmente a ratones NOD. Otras dianas de células T conocidas, incluyendo IAPP (52) , IMOGEN 38 (53-57) parecen no haberse caracterizado en ese sentido.

En la bibliografía científica abundan ejemplos del supuesto mimetismo molecular entre los autoantígenos y las proteínas virales basándose en la homología de secuencias (58) . Por ejemplo, en el caso de la DT1, se ha propuesto reactividad cruzada entre GAD65 y la proteína P2-C del Coxsackie B3 (59) o la proteína principal de unión a ADN de citomegalovirus humano (60) , e IA-2 con VP7 de rotavirus (61) o VP1 del Coxsackie B4 (62) . De manera similar, también se ha postulado el mimetismo entre proinsulina y GAD65 (63) . La exposición a un imitador molecular podría, en principio, desencadenar autoinmunidad, o proteger contra este, estableciendo y consolidando redes inmunitarias. Estudios epidemiológicos de desencadenamiento autoinmunitario por agentes infecciosos en seres humanos, no han sido particularmente informativos posiblemente debido al largo pródromo de la enfermedad y al fracaso para identificar un organismo específico (o serotipo inusual de un patógeno común) que está implicado... [Seguir leyendo]

1. Un fragmento de ZnT8 que consiste en un fragmento representado por una cualquiera de las SEC ID Nº : 9, 10, 14-18, 22, 23.

4. 51 .

5. 65, en donde el fragmento comprende la secuencia de aminoácidos SLTIQMES (posicione.

34. 353 de la SEC ID Nº : 2) y la posición 325 de la SEC ID Nº : 2.

2. Una proteína quimérica, que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en, cualquiera de dos o más fragmentos representados en la reivindicación 1.

3. La proteína quimérica de la Reivindicación 2, en donde la proteína quimérica comprende un fragmento N-terminal de ZnT8 y un fragmento C-terminal de ZnT8.

4. La proteína quimérica de la Reivindicación 2, en donde la proteína quimérica comprende dos fragmentos Cterminal de ZnT8, en donde cada uno de los fragmentos comprende un aminoácido diferente en la posición 325.

5. La proteína quimérica de la Reivindicación 4, en la que un fragmento comprende una arginina en la posición 325 y en la que un segundo fragmento comprende un triptófano en la posición 325.

6. El fragmento de la Reivindicación 1, en donde el fragmento comprende al menos un epítopo de ZnT8 que está selectivamente unido mediante un anticuerpo anti-ZnT8.

7. El fragmento de la Reivindicación 6, en el que el anticuerpo anti-ZnT8 es un anticuerpo obtenido de un individuo.

8. El fragmento de la Reivindicación 6, en donde el individuo tiene, o se sospecha que tiene, diabetes de tipo I.

9. Uso del fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para el diagnóstico de un individuo que es susceptible a, o que está desarrollando una enfermedad autoinmunitaria, que comprende detectar, en una muestra de ensayo del individuo, anticuerpos que se unen selectivamente al fragmento ZnT8, en donde la detección del aumento de anticuerpos en el individuo comparada con un control negativo, indica que el individuo es susceptible a,

o está desarrollando, la enfermedad autoinmunitaria.

10. El uso de la Reivindicación 9, en el que el aminoácido en la posición 325 del fragmento se selecciona del grupo que consiste en arginina, triptófano y glutamina.

11. El uso de la Reivindicación 9, en el que la enfermedad autoinmunitaria es la diabetes de tipo I.

12. Uso de los fragmentos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 6 a 8 para controlar en un individuo la progresión de la diabetes autoinmunitaria de tipo I, a partir de una autorreactividad benigna inicial a insulinitis destructora, que comprende detectar anticuerpos que se unen selectivamente al fragmento ZnT8 en una muestra de ensayo del individuo, en donde la detección del aumento de anticuerpos en el individuo comparada con una medición previa de anticuerpos en el mismo individuo, indica que el individuo está progresando hacia insulinitis destructora.

13. El uso de la Reivindicación 12, en el que el aminoácido en la posición 325 del fragmento se selecciona del grupo que consiste en arginina, triptófano y glutamina.

14. Uso de los fragmentos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 6 a 8 para controlar la eficacia de un tratamiento para prevenir la diabetes de tipo I, retrasar la aparición de la diabetes de tipo I, o mejorar la autoinmunidad en individuos prediabéticos, que comprende detectar anticuerpos que se unen selectivamente al fragmento ZnT8 en una muestra de ensayo del individuo, en donde la detección de la disminución del nivel o sustancialmente del mismo nivel de anticuerpos en el individuo comparada con una medición previa de anticuerpos en el mismo individuo, indica que el tratamiento es eficaz, y en donde la detención del aumento de anticuerpos en el individuo comparada con una medición previa de anticuerpos en el mismo individuo indica que el tratamiento no es eficaz.

15. El uso de la Reivindicación 14, en el que el aminoácido en la posición 325 del fragmento se selecciona del grupo que consiste en arginina, triptófano y glutamina.

16. El uso de una cualquiera de las Reivindicaciones 9-15, en donde el uso incluye el uso de un ensayo seleccionado del grupo que consiste en: ensayo de radioinmunoprecipitación, ELISA, ensayo de inmunofluorescencia, ensayo de fluorescencia resuelta en tiempo, ensayos de separación de células activadas por fluorescencia, ensayo competitivo con Europio y ensayo con luminiscencia.

Intraensayo CV: 23 % (n=6)