Procedimiento para detectar pirofosfato con detección de bioluminiscencia.

Procedimiento para detectar pirofosfato, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

(a) puesta en contacto de los componentes de una composición que comprende deshidroluciferina, luciferina, ATP y luciferasa que es activable por pirofosfato, con la muestra de ensayo y

(b) medición de la luminiscencia.

Procedimiento para detectar pirofosfato con detección de bioluminiscencia

La invención se refiere a procedimientos para detectar pirofosfato con detección de bioluminiscencia. Además, se describen procedimientos para medir reacciones químicas, particularmente catalizadas por enzima, en las que se produce o se consume pirofosfato. Dichas reacciones se catalizan, por ejemplo, por guanilato ciclasas, adenilato ciclasas, ADN o ARN polimerasas.

Los nuevos procedimientos se caracterizan por una alta sensibilidad y una baja susceptibilidad de error, admiten fácilmente automatización y miniaturización y son adecuados además para la realización de mediciones continuas. Los procedimientos pueden utilizarse con especial ventaja en el campo del diagnóstico médico y de la investigación biomédica, incluyendo la investigación de principios activos farmacéuticos.

El pirofosfato (difosfato (V), PPi) es un metabolito básico del metabolismo celular que se produce o consume en numerosas reacciones enzimáticas; así, por ejemplo, se realizan reacciones metabólicas básicas como la síntesis de polisacáridos, proteínas y ácidos nucleicos con producción de pirofosfato. El pirofosfato aparece además también en el entorno inanimado y se produce o consume en distintas reacciones industriales.

Los procedimientos para detectar y cuantificar pirofosfato pueden utilizarse por tanto en distintos campos; es de especial interés el uso en el campo del diagnóstico médico, la investigación biomédica, particularmente la investigación de principios activos, y la investigación de medicamentos, así como en el campo del análisis ambiental y alimentario. A este respecto, es importante, además del análisis de los contenidos de pirofosfato, sobre todo la medición de reacciones químicas en las que se produce o consume pirofosfato, así como la determinación de las actividades enzimáticas que catalizan dichas reacciones.

En el campo del diagnóstico médico, se ofrece el empleo de procedimientos para detectar pirofosfato en todas partes donde el contenido de pirofosfato de la muestra de ensayo pueda ser un indicador de una alteración patológica. Pueden ser especialmente interesantes muestras de fluidos corporales o procesamientos de tejidos, por ejemplo, muestras de sangre, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial o procesamientos de las mismas. Los procedimientos para analizar dichas muestras de ensayo deben caracterizarse por la sensibilidad más alta posible y una baja susceptibilidad de error, particularmente frente a componentes de muestra típicos como, por ejemplo, fosfato o ATP. Además, es deseable para una realización eficaz y económica de los análisis que los procedimientos admitan una fácil automatización y miniaturización.

En el campo de la investigación biomédica, particularmente de la investigación de principios activos farmacéuticos, se exploran regularmente para el descubrimiento de nuevos candidatos a principios activos grandes colecciones de sustancias de algo más de un millón de sustancias con ayuda de procedimientos automatizados(cribado de alto rendimiento; High Throughput Screening); a este respecto, el cribado se dirige normalmente a la identificación de moduladores de una actividad biológica, por ejemplo una actividad enzimática, que podría ser la diana de una terapia médica. Las enzimas que catalizan reacciones productoras o consumidoras de pirofosfato, y podrían ser la diana de una terapia médica son, por ejemplo, guanilato ciclasas, adenilato ciclasas, ADN y ARN polimerasas así como escualeno sintasa. Los procedimientos para medir dichas actividades enzimáticas en cribado farmacológico de alto rendimiento deben admitir una fácil automatización y también miniaturización para limitar los costes de reactivos y sustancias de ensayo. Además, para detectar también actividades enzimáticas bajas, es deseable una sensibilidad lo más alta posible, y para conseguir una alta calidad de datos, una susceptibilidad de error lo más baja posible.

Para caracterizar además la cinética enzimática de los moduladores, incluyendo la determinación del mecanismo de inhibición, la velocidad de producción y disociación del complejo enzima-modulador o los gastos de energía ligados a la producción y disociación del complejo enzima-modulador, se registra y evalúa normalmente el desarrollo de las reacciones enzimáticas examinadas. Los procedimientos adecuados deben por tanto reproducir el desarrollo de la reacción con una resolución temporal lo más alta posible, idealmente de forma continua.

Puede ser deseable una medición continua de la concentración de pirofosfato también en aplicaciones en el campo del análisis genómico y del análisis de la expresión génica, por ejemplo, en la secuenciación de ácidos nucleicos (pirosecuenciación) o la medición de amplificaciones de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR cuantitativa). A este respecto, los procedimientos adecuados se caracterizan adicionalmente por una susceptibilidad de error lo más baja posible frente a fosfato y ATP.

La bioluminiscencia es un fenómeno ampliamente extendido en la naturaleza, pero también aprovechado industrialmente, y designa la emisión de luz en el desarrollo de una reacción química catalizada por enzima; las reacciones bioluminogénicas se catalizan por ejemplo por luciferasas o fotoproteínas. Es conocida desde hace tiempo la descarboxilación oxidativa catalizada por luciferasa de Photinus pyralis de D-luciferina hasta oxiluciferina en presencia de trifosfato de adenosina (ATP), Mg2+ y oxígeno (2). Se exponen más detalladamente exámenes para la caracterización de esta reacción, así como del mecanismo de reacción, por ejemplo, en McEIroy, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 33 (1947) 342-345, McEIroy, J. Biol. Chem. 191 (1951) 547-557, McEIroy et al., Arch. Biochem. Biophvs. 46 (1953) 399-416, Green y McEIroy, Biochim. Biophvs. Acta 2 (1956) 17-176, Bitler y McEIroy, Arch. Biochem. Biophvs. 72 (1957) 358-368, Rhodes et al., J. Biol. Chem. 233 (1958) 1528-1537, White et al., J. Am.

Chem. Soc. 85 (1963) 337-343, Denburg et al., Arch. Biochem. Biophvs. 134 (1969) 381-394, Lee et al., Arch. Biochem. Biophvs. 141 (197) 38-52, Denburg y McEIroy, Arch. Biochem. Biophvs. 141 (197) 668-675, Lundin, (1993) en: "Biolum. Chemilum.: Status Report" (Ed. Szalay, Kricka), 291-295, Fontes etai, Biochem. Biophvs. Res. Común. 237 (1997) 445-45, Fontes et al., FEBS Lett. 438 (1998) 19-194, Sillero et al., Pharmacol. Therap. 87 (2) 91-12, WO 964988 y Eriksson et al., Anal. Biochem. 293 (21) 67-7; a este respecto, se describen tanto efectos activadores como inhibidores del pirofosfato. La luz luminiscente emitida en la reacción puede medirse muy sensiblemente y seguirse exactamente así el desarrollo de la reacción. La reacción catalizada por luciferasa de Photinus pyralis se utiliza habitualmente para detectar ATP, pero también para medir reacciones enzimáticas en la que se produce o consume ATP (Lundin (1982), en "Luminescent Assays: Perspectives in Endocrinology and Clin. Chem." (Ed. Serio, Pazzagli) 29-45). El gen de luciferasa de Photinus pyralis se usa además a menudo como gen indicador en sistemas de ensayo celulares (Gould et al., Anal. Biochem. 175 (1988) 5-13).

Es conocido que todas las luciferasas de coleópteros (luciferasas aisladas de las superfamilias Elateroidea y Cantharoidea) catalizan una reacción bioluminogénica que consume el mismo sustrato, trifosfato de adenosina (ATP), luciferina y oxígeno molecular. Se supone que todas las luciferasas de coleóptero usan el mismo mecanismo de reacción (documento US 6.387.675 B1).

En el estado de la técnica, son conocidos distintos procedimientos para detectar pirofosfato.

Flynn et al., J. Biol. Chem. 211 (1954) 791-796, Grindey et al., Anal. Biochem. 33 (197) 114-119, Putnins et al., Anal. Biochem. 68 (1975) 185-195, Heinonen et al., Anal. Biochem. 117 (1981) 293-3 y Mansurova et al., Anal, Biochem. 176 (1991) 39-94 describen procedimientos de detección química directa de pirofosfato. En los procedimientos descritos, se hace reaccionar la muestra de ensayo que contiene pirofosfato con una solución ácida de molibdato y un reactivo de tiol reductor (cisteína, disulfuro/tioglicerol o mercaptoetanol) y se cuantifican los complejos azules generados por espectrometría UV. Es problemática la susceptibilidad de error de estos procedimientos de detección, particularmente frente a fosfato. Además, es desventajoso para una realización automatizada eficaz la lenta producción de complejo (con cisteína >1-15 min).

Heinonen et al., Anal. Biochem. 59 (1974) 366-374 y Russel et al., J. Clin. Invest. 5 (1971) 961-969 describen procedimientos radiactivos de detección que comprenden varias etapas... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para detectar pirofosfato, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

(a) puesta en contacto de los componentes de una composición que comprende deshidroluciferina, luciferina, ATP y luciferasa que es activable por pirofosfato, con la muestra de ensayo y

(b) medición de la luminiscencia.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de ensayo procede de una fuente natural que comprende entorno vivo e inanimado.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de ensayo procede de un organismo vegetal o animal.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de ensayo procede del cuerpo humano.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de ensayo es una reacción química productora o consumidora de pirofosfato.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de ensayo es una reacción enzimática productora o consumidora de pirofosfato.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se realiza la determinación de la concentración de pirofosfato con resolución temporal.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 o 7, en el que la reacción enzimática se selecciona del grupo compuesto por reacciones enzimáticas productoras de pirofosfato o consumidoras de pirofosfato, reacciones catalizadas por guanilato ciclasa, reacciones catalizadas por adenilato ciclasa, reacciones catalizadas por escualeno sintasa, reacciones catalizadas por pirofosfatasa, reacciones catalizadas por ADN polimerasa o reacciones catalizadas por ARN polimerasa.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 7, caracterizado porque la reacción enzimática se cataliza mediante guanilato ciclasa vascular soluble.

1. Solución acuosa que comprende deshidroluciferina en un intervalo de concentración de 5 a 25 pM, luciferina en un intervalo de concentración de 1 a 5 pM, ATP en un intervalo de concentración de 1 a 5 pM y luciferasa de Photinus pyralis en un intervalo de concentración de ,1 a 1 nM.

11. Solución acuosa según la reivindicación 1, caracterizada porque la luciferasa de Photinus pyralis es una luciferasa de Photinus pyralis no recombinante o recombinante, luciferasa de Photinus pyralis derivada o mutada de la misma o una mezcla derivada de la misma.