Detección de la descomposición de enzimas en un elemento de ensayo por liberación controlada de un analito protegido.

Elemento diagnóstico para determinar al menos un analito, que comprende

(a) un reactivo de detección específico del analito,

y

(b) una cantidad definida del analito buscado (analito indicador), el cual se encuentra en una forma inaccesible, pero liberable, para reaccionar con el reactivo de detección.

de las figuras

Figura 1: sección de una forma de ejecución de un elemento diagnóstico según la presente invención que consta de una capa de detección, una capa fotomètrica de barrera separable, una capa de reserva que contiene el anallto Indicador y una capa soporte.

Figura 2: sección de una forma de ejecución alternativa de un elemento diagnóstico según la presente invención que consta de una capa de detección, una capa fotomètrica de barrera separable que contiene el analito indicador y una capa soporte.

Figura 3: sección de la capa protectora de un elemento diagnóstico según la presente invención que contiene el anallto Indicador (en este caso glucosa) en forma encapsulada.

Figura 4: sección de la capa de detección de un elemento diagnóstico según la presente invención que contiene el anallto Indicador (en este caso glucosa) en forma encapsulada.

Figura 5: cinética de la reacción del anallto Indicador o del anallto de la muestra mediante el sistema enzimàtico de un elemento diagnóstico según la presente Invención.

5A: liberación del anallto Indicador antes del ¡nielo de la reacción del analito de la muestra mediante el sistema enzimàtico.

5B: liberación del anallto Indicador tras el final de la reacción del analito de la muestra mediante el sistema enzimàtico.

Figura 6: detección fluorlmétrlca del anallto Indicador mediante liberación fotomètrica y la subsiguiente reacción enzimàtica.

6A: fluorescencia de un elemento diagnóstico, que contiene el analito indicador en forma modificada, irradiado con luz de longitud de onda adecuada antes y después de ponerlo en contacto con una solución de enzima (GlucDH) y coenzlma (NAD).

6B: fluorescencia de un elemento diagnóstico que no contiene el analito indicador, en ausencia o en presencia de una solución de enzima (GlucDH) y coenzima (NAD).

Figura 7: detección fluorimétrica del analito indicador mediante formación térmica de huecos y la subsiguiente reacción enzimàtica.

7A: fotografía digital de una capa polimèrica dotada de colorante (criptocianina) tras 20 minutos de irradiación con luz de longitud de onda adecuada.

7B: fotografía digital de una capa polimèrica dotada de colorante (criptocianina) tras 20 minutos de irradiación con luz de longitud de onda adecuada y subsiguiente puesta en contacto con una solución de enzima (GlucDH) y coenzima (NAD).

7C: fotografía digital de una capa polimèrica dotada de colorante (criptocianina) tras la puesta en contacto con una solución de enzima (GlucDH) y coenzima (NAD), sin irradiación previa.

Figura 8: representación de las secuencias de aminoácidos de los dobles mutantes de glucosa deshidrogenasa GlucDH_E96G_E170K y GlucDH_E170K_K252L.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: preparación y empleo de un elemento diagnóstico con analito indicador en forma modificada

Sobre una lámina soporte de Pokalon (de la firma Lonza) se aplicó conjuntamente glucosa modificada (derivado de tris-veratrilo) y poliacrilamida (de la firma Aldrich). A continuación el elemento de ensayo bicapa así obtenido se colocó sobre un aparato medidor de luminiscencia (de propia construcción de la firma Roche) y se irradió durante 2 minutos con luz de una longitud de onda de 375 nm. Entonces, para detectar la liberación de glucosa a partir del derivado de glucosa utilizado en el elemento de ensayo se aplicó una solución de 10 mg de glucosa deshidrogenasa (GlucDH, de la firma Roche) y 10 mg de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD, de la firma Roche) en 10 mi de tampón de fosfato pH 7 (de la firma Merck) sobre el elemento diagnóstico y se hizo el seguimiento fluorimétrico de la formación de NADH (véase la figura 6A).

Como referencia se midieron respectivamente por fluorimetria las láminas de Pokalon vacías o en combinación con la solución de GlucDH y NAD arriba descrita (véase la figura 6B).

Ejemplo 2: preparación y empleo de un elemento diagnóstico con analito indicador libre y matriz polimèrica dotada de colorante

Para elaborar un elemento diagnóstico con matriz polimèrica dotada de colorante se prepararon dos disoluciones parciales 1 y 2 que tenían las siguientes composiciones:

Disolución parcial 1:

L

I Pesada (g) I Contenido de sólidos (%) ¡ Sólidos (g) I % sobre sólidos totales ¡

1. Elemento diagnóstico para determinar al menos un analito, que comprende

(a) un reactivo de detección específico del analito, y

(b) una cantidad definida del analito buscado (analito indicador), el cual se encuentra en una forma inaccesible, pero liberable, para reaccionar con el reactivo de detección.

2. Elemento diagnóstico según la reivindicaciónl, caracterizado porque el reactivo de detección comprende un enzima o/y un coenzima, siendo el enzima preferentemente una deshidrogenasa dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD/NADH) o de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP/NADPH), sobre todo una glucosa deshidrogenasa (EC 1.1.1.47) o una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.49) o/y el coenzima un compuesto estabilizado de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD/NADH) o de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP/NADPH), sobre todo carbaNAD o carbaNADP, o un compuesto de la fórmula (I)

O

ii

P.

I^OH

OH

(!)

3. Elemento diagnóstico según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el reactivo de detección incluye además un mediador o/y un indicador óptico, o/y porque el analito indicador lleva un grupo protector fotoquímica o/y electroquímicamente disociable.

4. Elemento diagnóstico según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende una capa soporte y una capa de detección que contiene el reactivo detector, o/y está estructurado para la determinación de varios analitos.

5. Elemento diagnóstico según la reivindicación 4, caracterizado porque contiene el analito indicador en la capa de detección o en una capa de reserva separada de aquella, de manera que entre la capa de reserva y la capa de detección hay preferiblemente una capa de barrera disgregable.

6. Elemento diagnóstico según la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque la capa de detección, la capa de barrera o/y la capa de reserva comprende una matriz polimèrica que contiene al menos un absorbente de energía, el cual es preferiblemente un colorante hidrófobo escogido entre los colorantes de cianina, sobre todo criptocianina, indotricarbocianina (C7), oxacarbocianina (C3), yoduro de pinacianol, tiacarbocianina (C3), tiadicarbocianina (C5) y un colorante de escuarilio, en particular el colorante de escuarilio III.

7. Elemento diagnóstico según la reivindicación 6, caracterizado porque la matriz polimèrica está formada por al menos un polímero hidrófobo, seleccionado en concreto del grupo constituido por un poli(metacrilato de metilo), un poli(metacrilato de etilo), un policarbonato y derivados químicos de los mismos, o/y porque contiene al menos un absorbente de energía unido covalentemente o/y en forma libre.

8. Elemento diagnóstico según la reivindicación 6 o 7, caracterizado porque el analito indicador se encuentra encapsulado en la matriz polimèrica.

9. Elemento diagnóstico según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque está configurado como cinta de ensayo, disco de ensayo, pastilla de ensayo, tira de ensayo o bobina de tiras de ensayo.

10. Aparato de medición analítico que lleva un elemento diagnóstico según una de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Método para determinar un analito que comprende las siguientes etapas:

(a) poner en contacto el analito con un elemento diagnóstico según una de las reivindicaciones 1 a 9, y

(b) determinar la presencia o/y la cantidad del analito.

12. Método para corregir una señal generada por un analito, que comprende las siguientes etapas:

(a) introducir un elemento diagnóstico según una de las reivindicaciones 1 hasta 9 en un aparato de medición analítico,

(b) generar una primera señal detectable en el aparato de medición analítico poniendo en contacto el analito con el elemento diagnóstico,

5 (c) generar una segunda señal detectable en el aparato de medición analítico liberando el analito indicador en el

elemento diagnóstico, y

(d) corregir la señal generada en (b) con el uso de la señal generada en (c).

13. Método para comprobar la óptica de detección de un aparato de medición analítico, que incluye las etapas

10 siguientes:

(a) introducción de un elemento diagnóstico según una de las reivindicaciones 1 a 9 en el aparato de medición analítico,

(b) generación de una señal detectable en el aparato de medición analítico por liberación del analito indicador en

15 el elemento diagnóstico, y

(c) correlación de la señal generada en (b) con una señal de referencia.

14. Sistema de liberación controlada de un reactivo para la detección específica de un analito, que comprende

(a) un soporte que lleva el reactivo y un sistema de reacción separado del reactivo, de modo que éste se halla en

20 una forma Inaccesible para reaccionar con el sistema de reacción, pero se puede liberar en unas condiciones

definidas,

(b) medios para liberar el reactivo sobre el soporte.

15. Sistema según la reivindicación 14, caracterizado porque el reactivo se halla encapsulado en una matriz 25 disgregable y está separado del sistema de reacción por una capa de barrera dlsgregable o/y lleva un grupo químico

protector.

16. Uso de un sistema según la reivindicación 14 o 15 como elemento de conmutación.