Descubrimientos de genes vinculados a la expresión.

Un método para la identificación de ADN genómico en una muestra,

que comprende

- aislamiento del ARNm a partir de un organismo seleccionado y preparar a partir de dicho ARNm como molde fragmentos pequeños de ADNc monocatenario con un adaptador que contiene un marcador de biotina y al menos un adaptador que contiene un sitio de restricción de la endonucleasa de restricción tipo IIs raro;

- aislamiento de ADN genómico a partir del mismo o un organismo relacionado y preparar a partir de dicho ADN genómico monocatenario fragmentos de ADN genómico ligados a las moléculas adaptadoras;

- hibridación de dichos fragmentos de ADN genómico monocatenarios con dichos fragmentos de ADNc monocatenario y amplificación de dichos híbridos; y

- secuenciación de alto rendimiento de dichos híbridos.

Descubrimientos de genes vinculados a la expresión.

La invención se refiere al campo de la biología molecular y la biotecnología, más específicamente al campo de la secuenciación, la detección y la identificación de secuencias de ácidos nucleicos en el ADN genómico. Más en particular, la invención se refiere a la aplicación de un método en la identificación y/o detección de secuencias de nucleótido que representan la mayoría de las regiones transcritas y su entorno en un genoma y que están relacionados con una amplia variedad de rasgos genéticos, genes y combinaciones de los mismos. La invención se puede usar en el campo de la detección de alto rendimiento y la identificación de marcadores moleculares a partir de cualquier origen, ya sea de plantas, animales, humanos, artificial o de otra manera.

Las tecnologías de cría han evolucionado de la simple selección de rasgos visibles en métodos para la detección de rasgos multigénicos usando marcadores moleculares. En principio, cada diferencia genética entre diferentes líneas de una población de cruce puede representar un rasgo alterado. Sin embargo, debido a la complejidad de la mayoría de los genomas no es posible identificar cada diferencia que existe entre los genomas y vincularlo a un rasgo particular. En teoría, la secuenciación completa de los genomas revelaría todas las diferencias entre los genomas. Sin embargo, esto no se puede realizar de forma práctica, con tiempo y costos efectivos con las tecnologías de secuenciación actuales. Por lo tanto, los métodos para la detección de las diferencias genéticas principalmente se han basado en el principio de reducción de la complejidad que implica la secuenciación de una parte limitada pero completamente definida del ADN genómico de diferentes individuos. Con los avances en las tecnologías de secuenciación la reducción de la complejidad se ha hecho menos importante para algunas aplicaciones como análisis de transcriptomas que representan todas las secuencias de genes expresados. El tamaño de los genomas eucariotas que van desde unas pocas decenas a varios cientos de megabases, está sin embargo, más allá de la capacidad de las tecnologías actuales de secuenciación de alto rendimiento. Además, la gran mayoría del ADN genómico en los organismos eucariotas, especialmente aquellos con tamaños más grandes del genoma, no proporciona información valiosa para fines de reproducción, ya que nunca se expresa y por lo tanto no parece contribuir a la expresión de rasgos Por lo tanto, para identificar marcadores moleculares, los métodos que se centran en las partes de un genoma que son más propensos a revelar los marcadores moleculares estrechamente vinculados a los rasgos tienen una ventaja sobre los métodos que analizan selecciones simplemente al azar de genomas que incluyen áreas no expresadas. Este problema se hace más agudo cuando el tamaño del genoma aumenta. El método descrito hace posible determinar secuencias en una parte seleccionada del ADN genómico que representa las regiones codificantes de la mayoría de los genes expresados y su entorno. La comparación de dichas partes seleccionadas entre diferentes individuos permite la identificación de sitios polimórficos que están dentro o en las cercanías de los genes expresados. Ya que la frecuencia de polimorfismos es superior en regiones no codificantes, más polimorfismos se pueden relacionar a los genes expresados que con las tecnologías actuales. Además grandes regiones no codificantes que rodean genes más conservados se pueden analizar por la presencia de polimorfismos. Esto puede en última instancia resultar en el descubrimiento de al menos un marcador por rasgo. El método de la invención hace posible enfocarse en la detección SNP en las áreas de codificación de genes y las áreas reguladoras de genes por la iluminación de partes bien definidas del genoma entre diferentes individuos y organismos, aun en organismos con genomas complejos y grandes Los polimorfismos de las secuencias de nucleótidos, como SNPs se aplican ampliamente para construir mapas del genoma. Después de que los polimorfismos se vinculan a fenotipos en un proceso llamado mapeo genético, tales polimorfismos se pueden usar como marcadores en tecnologías de cría asistida por marcadores para detectar un fenotipo particular en cualquier etapa del desarrollo. Los polimorfismos de la secuencia de nucleótidos se identifican generalmente en el ADN genómico. Como el tamaño del genoma de todos los organismos eucarióticos supera con creces el número de nucleótidos que se pueden analizar con las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento actuales, se necesitan procedimientos reproducibles para reducir la complejidad para analizar las partes seleccionadas de los genomas completos para encontrar diferencias genéticas entre individuos que se puedan usar para el mapeo genómico. Sin embargo, la naturaleza estadística de los métodos de reducción de complejidad que se aplican actualmente, implica que estos métodos no revelan a priori aquella diferencias genéticas que se pueden vincular a fenotipos únicos o se mapean cercanamente a genes que contribuyen a un genotipo particular.

Las tecnologías actuales se enfocan fuertemente en el descubrimiento de polimorfismos de un único nucleótido (SNPs) por varias razones: SNPs se presentan más frecuentemente en los genomas que cualquier otro tipo de polimorfismo, SNPs permiten la detección precisa de alelos homocigotos y heterocigotos, SNPs se pueden aplicar en aplicaciones de alto rendimiento y están disponibles muchas plataformas industriales que hacen la detección de SNP a cualquier escala de

aplicación deseada rentable. Aunque el descubrimiento de SNP sería el método de elección en situaciones donde ocurren bajos niveles de polimorfismo, como áreas de codificación de genes conservados y genomas de individuos estrechamente relacionados, el uso del banco EST para el descubrimiento de SNP en individuos que están estrechamente relacionados puede ser menos efectivo debido a un nivel inherentemente bajo de polimorfismo. En conclusión, un método de descubrimiento de SNP debería idealmente revelar todos los SNPs presentes que están físicamente vinculados a rasgos de interés, pero no debe obstaculizarse por los bajos niveles de polimorfismo que se producen en las áreas de codificación de genes del genoma u obstaculizarse por ningún requisito de conocimiento de las secuencias del genoma. Así se necesita un método que pueda determinar reproduciblemente secuencias concomitantes en áreas de ADN genómico que representan la mayoría de las regiones de codificación de genes y las regiones de su entorno, esto sin previo conocimiento de las secuencias del genoma o el transcriptoma. En la técnica anterior se conoce de Estados Unidos 2003/099962 que se pueden preparar pequeños fragmentos de ADNc monocatenario y pequeños fragmentos de ADN genómico monocatenario, los que después pueden hibridarse, amplificarse y los productos amplificados de los mismos secuenciarse. Sin embargo, en este documento de la técnica anterior los fragmentos genómicos se obtienen mediante el uso de una etapa de clonación consumidora de tiempo. Espelund y otros, (Biotechniques 13 (1) :74-81, 1992) indica que una etapa de clonación de este tipo puede reemplazarse por una amplificación por PCR usando adaptadores. Sin embargo, se necesita un método (mejorado) para determinar reproduciblemente las secuencias genómicas en base al transcriptoma, sin conocimiento previo de la información de la secuencia en la misma.

Breve descripción de la invención Los inventores actuales han encontrado ahora un método para analizar una región genómica de un organismo, que comprende cuatro partes principales. La primera parte implica el aislamiento de ARNm de un organismo seleccionado que se usa para la preparación de fragmentos pequeños de ADN monocatenario con un adaptador que contiene un marcador de biotina y al menos un adaptador que contiene un sitio de endonucleasa de restricción tipo IIs raro. Estos fragmentos de ADN se usan en la tercera parte. En la segunda parte, se aísla el ADN genómico del mismo organismo o de uno relacionado. Este ADN genómico se fragmenta y se liga a las moléculas adaptadoras. En esta tercera parte estos fragmentos genómicos se hibridan con los fragmentos de ADN monocatenario a partir de la parte uno y los híbridos formados en este proceso se usan para la síntesis de fragmentos de ADN. Estos fragmentos se usarán en la cuarta parte, que implica la secuenciación de estos fragmentos usando uno de los métodos de secuenciación de alto rendimiento disponibles. Dicho método de identificación de ADN genómico en una muestra por lo tanto puede comprender las etapas de:

a) aislamiento y purificación de ARNm de las... [Seguir leyendo]

1. Un método para la identificación de ADN genómico en una muestra, que comprende

- aislamiento del ARNm a partir de un organismo seleccionado y preparar a partir de dicho ARNm como molde fragmentos pequeños de ADNc monocatenario con un adaptador que contiene un marcador de biotina y al menos un adaptador que contiene un sitio de restricción de la endonucleasa de restricción tipo IIs raro; -aislamiento de ADN genómico a partir del mismo o un organismo relacionado y preparar a partir de dicho ADN genómico monocatenario fragmentos de ADN genómico ligados a las moléculas adaptadoras; -hibridación de dichos fragmentos de ADN genómico monocatenarios con dichos fragmentos de ADNc monocatenario y amplificación de dichos híbridos; y -secuenciación de alto rendimiento de dichos híbridos.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de

a) aislamiento y purificación de ARNm de las muestras de tejido de un organismo; b) síntesis de ADNc mediante el uso de dicho ARNm como un molde; c) opcionalmente reducción de la complejidad de dicho ADNc; d) fragmentación de dicho ADNc; e) opcionalmente selección de tamaño de dichos fragmentos; f) opcionalmente eliminar los fragmentos que contienen poliA mediante la unión a perlas de afinidad recubiertas con estreptavidina; g) pulido de dichos fragmentos de ADNc; h) ligación de dichos fragmentos con un adaptador que comprende un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción rara y otro adaptador que contiene un marcador de biotina; i) opcionalmente selección de tamaño de dichos fragmentos; j) reparación de mellas de dichos fragmentos; k) selección de dichos fragmentos que contienen ambas secuencias adaptadoras; l) amplificación de dichos fragmentos mediante el uso de iniciadores de hibridación para las secuencias adaptadoras descritas en la etapa h, en donde y un iniciador es complementario al adaptador con un sitio de restricción raro y el otro iniciador contiene un marcador de biotina. m) unir de dichos fragmentos a perlas de afinidad recubiertas con estreptavidina; n) eliminar los adaptadores que contienen el sitio de restricción raros usando la enzima de restricción correspondiente a partir de dichos fragmentos; o) eliminar las cadenas simples no unidas a perlas de afinidad por una interacción biotina-estreptavidina de los fragmentos de ADN bicatenarios unidos a las perlas de afinidad a través de una interacción biotina-estreptavidina que resulta en cadenas sencillas de ADN unidas a las perlas de afinidad con estreptavidina; p) aislamiento y purificación del ADN genómico por ejemplo a partir del organismo de la etapa a q) fragmentación de dicho ADN genómico; r) opcionalmente pulir dicho ADN genómico; s) ligación de dicho ADN genómico con un solo tipo de adaptador o con dos tipos diferentes de adaptadores (preferido) t) fusionar dicho ADN genómico en un ADN monocatenario u) hibridar el ADN genómico de la etapa t) con ADN en las perlas de la etapa o) ; v) eliminar el ADN genómico no unido por lavado w) extensión del híbrido del ADN genómico-ADNc por una polimerasa para crear un molde bicatenario x) realizar la PCR sobre dicho híbrido de ADN genómico-ADNc y) selección de los fragmentos mayores de aproximadamente 100 pares de base a partir de dicha PCR por fraccionamiento de tamaño z) opcionalmente purificación de dichos fragmentos aa) secuenciación de alto rendimiento de dichos fragmentos .

3. Método para la identificación de polimorfismos, que comprende todas las etapas del método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 y además ab) comparar los datos de la secuencia de dos o más muestras para identificar los polimorfismos.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde las secuencias de la etapa aa) se combinan en cóntigos de las secuencias solapantes individuales

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde las secuencias de la etapa ab) o los cóntigos de la reivindicación 3 se anotan por la anotación automática.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las secuencias se obtienen a partir de individuos que pertenecen a una especie y se comparan con datos de EST disponibles para revelar secuencias no codificantes, tales como secuencias de intrones y secuencias no codificantes internas genes.

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las secuencias se obtienen a partir de uno o más individuos pertenecientes a especies relacionadas y comparado con datos de EST disponibles revelan secuencias no codificantes, tales como secuencias de intrones y secuencias no codificantes internas de genes.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las secuencias se obtienen a partir de dos o más individuos que pertenecen a la misma especie y se compararon para revelar sitios polimórficos.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las secuencias se obtienen a partir de uno o más individuos de diferentes especies y se compararon para revelar sitios polimórficos.

10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las secuencias se obtienen a partir de uno o más individuos de diferentes especies y se compararon para revelar áreas conservadas en el ADN genómico.

11. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el adaptador que comprende un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción rara desde la etapa h) comprende el sitio de reconocimiento para la enzima 25 SapI.

12. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la fragmentación de los ácidos nucleicos se logra mediante nebulización.