Deleción de ADN mitocondrial de 3,4 kb para uso en la detección de cáncer.

Un procedimiento de detección de un cáncer en un individuo, que comprende:

a) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de una muestra biológica del individuo;

b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una secuencia correspondiente a la secuencia identificada en la SEQ ID NO: 1 usando un par de cebadores de amplificación, en el que uno del par de cebadores de amplificación usados en la amplificación de la región diana se superpone con un sitio de reinserción de la secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, después de recircularizar la secuencia;

c) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra correspondiente a la SEQ ID NO: 1 recircularizada con al menos un valor de referencia conocido.

Deleción de ADN mitocondrial de 3,4 kb para uso en la detección de cáncer Objeto de la Invención

Esta invención está relacionada con el campo de la genómica mitocondrial. En particular, está relacionada con una deleción de 3,4 kb en el genoma mitocondrial y su utilidad como indicador de cáncer.

Antecedentes de la Invención

ADN mitocondrial (ADNmt) como herramienta de diagnóstico

Las dinámicas de secuencia de ADNmt son herramientas de diagnóstico importantes. Las mutaciones en el ADNmt son a menudo indicadores preliminares de enfermedades en desarrollo, asociadas a menudo a mutaciones nucleares, y actúan como biomarcadores relacionados específicamente con: enfermedades tales como, pero sin limitación, daño de tejido y cáncer por tabaquismo y exposición pasiva a humo de tabaco (Lee et al., 1998; Wei, 1998); longevidad, basada en la acumulación de mutaciones genómicas mitocondriales que empiezan aproximadamente a los 20 años de edad y aumentan después de ello (von Wurmb, 1998); enfermedad metastásica causada por mutación o exposición a carcinógenos, mutágenos o radiación ultravioleta (Birch- Machin, 2000); artrosis; enfermedad cardiovascular, de Alzheimery de Parkinson (Shoffneref al., 1993; Sherratt et al., 1997; Zhang etal., 1998); pérdida de audición asociada a la edad (Seidman etal., 1997); degeneración del nervio óptico y disrritmia cardiaca (Brown et al., 1997; Wallace et al., 1988); exoftalmoplejia externa progresiva crónica (Taniike et al., 1992); aterosclerosis (Bogliolo et al., 1999); carcinomas tiroideos papilares y tumores tiroideos (Yeh etal., 2000); así como otros (p.ej. Naviaux, 1997; Chinnery y Turnbull, 1999).

Las mutaciones en sitios específicos del genoma mitocondrial pueden estar asociadas a ciertas enfermedades. Por ejemplo, las mutaciones en las posiciones 4216, 4217 y 4917 están asociadas a la neuropatía óptica hereditaria de Leber(NOHL) ("Mitochondrial Research Society"; Huoponen (2001); MitoMap). Se encontró en 5/5 pacientes que una mutación en 15452 estaba asociada a deficiencia de ubiquinol citocromo c reductasa (complejo III) (Valnot efa/,1999).

Específicamente, estas mutaciones o alteraciones incluyen mutaciones puntuales (transiciones, transversiones), deleciones (de una base a miles de bases), inversiones, duplicaciones (de una base a miles de bases), recombinaciones e inserciones (de una base a miles de bases). Además, se ha encontrado que alteraciones o deleciones de pares de bases específicos o combinaciones de las mismas, están asociadas al inicio temprano de cáncer de próstata, piel y pulmón, así como al envejecimiento (p.ej. Polyak etal., 1998), al envejecimiento prematuro, exposición a carcinógenos (Lee etal., 1998), etc.

Cáncer de próstata

El cáncer de próstata es un tumor sólido diagnosticado frecuentemente que se origina lo más probablemente en el epitelio prostético (Huang et al. 1999). En 1997, se cribó en casi 10 millones de hombres estadounidenses el antígeno específico de próstata (PSA), cuya presencia sugiere cáncer de próstata (Woodwell, 1999). Es más, esto indica un número aún mayor de hombres cribados mediante un examen rectal digital (ERD) inicial. El mismo año, 31 millones de hombres tuvieron un ERD (Woodwell, 1999). Además, el número anual de nuevos casos diagnosticados de cáncer de próstata en los Estados Unidos se estima en 179.000 (Landis etal., 1999). Es el segundo cáncer más comúnmente diagnosticado y la segunda causa principal de mortalidad por cáncer en los hombres canadienses. En 1997, el cáncer de próstata dio cuenta de 19.800 nuevos cánceres diagnosticados en hombres canadienses (28 %) (National Cáncer Instltute of Cañada). Se estima que de un 30 a un 40 % de todos los hombres de más de cuarenta y nueve (49) años tienen algunas células de próstata cancerosas, aunque solo de un 20 a un 25 % de estos hombres tienen una forma clínicamente significativa de cáncer de próstata (SpringNet- CE Connection, internet, www.springnet.com/ce/j803a.htm ). El cáncer de próstata exhibe una amplia variedad de comportamientos histológicos que implican factores tanto endógenos como exógenos, concretamente situaciones socioeconómicas, dieta, geografía, desequilibrio hormonal, historial familiar y constitución genética (Konishi et al. 1997; Hayward et al. 1998). Aunque ciertas alteraciones del ADNmt se han asociado anteriormente al cáncer de próstata, existe la necesidad de marcadores adicionales para la detección de cáncer de próstata.

Deleción de ADNmt de 3,4 kb y la detección de cáncer de próstata

En la solicitud PCT pendiente de la solicitante que ostenta el n° de publicación WO/06/111029 (cuyos contenidos completos se Incorporan a la presente como referencia), se identificó una deleción de un segmento de 3379 pb de ADNmt mediante amplificación del genoma mitocondrial completo de tejido de próstata. Se determinó que la deleción de 3379 pb (a la que se hace referencia como deleción de 3,4 kb) estaba localizada entre los

nucleótidos 10744-14124 del genoma mitocondrial. Se determinó que podía usarse la detección de esta deleción en el diagnóstico de cáncer de próstata cuando se ensayan muestras de tejido.

La deleción de 3,4 kb retira todos o parte de los siguientes genes del genoma de ADNmt: (i) la subunidad 4L de NADH deshidrogenasa, (¡i) la subunidad 4 de NADH deshidrogenasa, (iii) la subunidad 5 de NADH deshidrogenasa, (iv) histidina de ARNt, (v) ser¡na2 de ARNt y (vi) Ieuc¡na2 de ARNt.

Cáncer de mama

El cáncer de mama es un cáncer del tejido glandular de mama y es la quinta causa más común de muerte por cáncer. En 2005, el cáncer de mama causó 502.000 muertes (7 % de las muertes por cáncer; casi 1 % de todas las muertes) en todo el mundo (Nota descriptiva n° 297 de la Organización Mundial de la Salud). Entre las mujeres de todo el mundo, el cáncer de mama es el cáncer más común y la causa más común de muerte por cáncer (nota descriptiva n° 297 de la Organización Mundial de la Salud). Aunque ciertas alteraciones del ADNmt se han asociado anteriormente a cáncer de mama, por ejemplo en Parrella etal. (Cáncer Research: 61, 2001), existe la necesidad de marcadores adicionales para la detección de cáncer de mama.

Descripción de la Invención

La invención es un procedimiento de detección de un cáncer en un individuo que comprende:

a) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de una muestra biológica del individuo;

b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una secuencia correspondiente a la secuencia identificada en la SEQ ID NO:1 usando un par de cebadores de amplificación, en el que uno del par de cebadores de amplificación usados en la amplificación de la región diana se superpone con un sitio de reinserción de la secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, después de recircularizar la secuencia;

c) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra correspondiente a la SEQ ID NO: 1 recircularizada con al menos un valor de referencia conocido.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento de detección de un cáncer en un individuo

que comprende:

a) obtener una muestra biológica del individuo;

b) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de la muestra;

c) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción en la secuencia de ácido nucleico que se extiende aproximadamente de los residuos 10744 a 14124 del genoma de ADNmt;

d) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con al menos un valor de referencia conocido.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento de detección de un cáncer en un individuo que comprende:

a) obtener una muestra biológica del individuo;

b) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de la muestra;

c) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción en la secuencia de ácido nucleico que se extiende aproximadamente de los residuos 10744 a 14124 del genoma de ADNmt;

d) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene la deleción con la cantidad de deleción en una muestra de referencia de ADNmt de un tejido o fluido corporal no canceroso conocido;

en el que una cantidad elevada de la deleción en la muestra biológica, en comparación con la muestra de referencia, es indicativa de cáncer.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento de detección de un cáncer en un individuo que comprende:

a) obtener una muestra biológica del individuo;

b) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de la muestra;

c) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una deleción en la secuencia de ácido nucleico que se... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de detección de un cáncer en un individuo, que comprende:

a) extraer ADN mitocondrial, ADNmt, de una muestra biológica del Individuo;

b) cuantificar la cantidad de ADNmt en la muestra que tiene una secuencia correspondiente a la secuencia identificada en la SEQ ID NO: 1 usando un par de cebadores de amplificación, en el que uno del par de cebadores de amplificación usados en la amplificación de la región diana se superpone con un sitio de reinserción de la secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, después de recircularizar la secuencia;

c) comparar la cantidad de ADNmt en la muestra correspondiente a la SEQ ID NO: 1 recircularizada con al menos un valor de referencia conocido.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el al menos un valor de referencia conocido es la cantidad de secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1 recircularizada en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal no canceroso conocido.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el al menos un valor de referencia conocido es la cantidad de secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1 recircularizada en una muestra de referencia de ADNmt de tejido o fluido corporal canceroso conocido.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se realiza la etapa de cuantificación usando PCR en tiempo real.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que se usa un cebador de amplificación que tiene una secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 9 como uno del par de cebadores de amplificación para amplificar la región

diana.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el cáncer es cáncer de próstata.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el cáncer es cáncer de mama.

8. E procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es un tejido corporal o fluido corporal.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la muestra biológica es tejido de mama, tejido de próstata,

fluido de masaje prostático u orina.

10. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el valor de referencia es un umbral de ciclo.