Células recombinantes productoras de ácidos omega-aminocarboxílicos, ésteres de ácidos omega-aminocarboxílicos o sus lactamas.

Una célula que ha sido modificada mediante tecnología genética con respecto a su tipo salvaje de modo que,

en comparación con su tipo salvaje, es capaz de producir más ácidos ω-aminocarboxílicos, ésteres de ácidos ω- aminocarboxílicos o más lactamas derivadas de ácidos ω-aminocarboxílicos a partir de ácidos carboxílicos o ésteres de ácidos carboxílicos, presentando la célula una actividad, incrementada en comparación con su tipo salvaje, de las enzimas EI y EIII o de las enzimas EI, EII y EIII:

i) de una enzima EI que cataliza la reacción de ácidos carboxílicos o ésteres de ácidos carboxílicos para dar los correspondientes ácidos ω-hidroxicarboxílicos o ésteres de ácidos ω- hidroxicarboxílicos, elegida del grupo consistente en las alcano monooxigenasas:

alcano monooxigenasa codificada por alkBGT de Pseudomonas putida GPo1 y citocromo-P450- monooxigenasas de Candida tropicalis;

ii) de una enzima EII que cataliza la reacción de ácidos &omegaa,-hidroxicarboxílicos o ésteres de ácidos ω- hidroxicarboxílicos para dar los correspondientes ácidos ω-oxocarboxílicos o ésteres de ácidos ω- oxocarboxílicos, elegida del grupo consistente en las alcoholdeshidrogenasas codificadas por el gen alkJ;

iii) de una enzima EIII que cataliza la reacción de ácidos ω-oxocarboxílicos o ésteres de ácidos ω- oxocarboxílicos para dar los correspondientes ácidos ω-aminocarboxílicos o ésteres de ácidos ω- aminocarboxílicos, elegida del grupo de las ω-transaminasas.

Células recombinantes productoras de ácidos ro-aminocarboxílicos, ásteres de ácidos ro-aminocarboxílicos o sus lactamas

La presente invención se refiere a células modificadas por tecnología genética con respecto a su tipo salvaje, a un procedimiento para la preparación de ácidos ro-aminocarboxílicos, ásteres de ácidos ro-aminocarboxílicos o de lactamas derivadas de ácidos ro-aminocarboxilicos, y a un procedimiento para la preparación de poliamidas basadas en ácidos ro-aminocarboxílicos o en lactamas.

Las poliamidas son polímeros cuyas unidades repetitivas (monómeros) poseen como rasgo característico el grupo amida. La denominación "poliamida" se utiliza habitualmente como denominación para materiales sintéticos termoplásticos técnicamente utilizables, y con ello delimita esta clase de sustancias de las proteínas químicamente emparentadas. Casi todas las poliamidas importantes se derivan de aminas primarias, es decir, en sus unidades repetitivas se presenta el grupo funcional -CO-NH-. Junto a ellas existen también poliamidas de aminas secundarias (-CO-NR-, R = radical orgánico). En calidad de monómeros para las poliamidas encuentran aplicación, en particular, ácidos aminocarboxílicos, lactamas y/o diaminas y ácidos dicarboxílicos.

Particular importancia se le otorga, en especial, a la preparación de poliamidas a base de lactamas. Así, mediante polimerización mediante apertura del anillo de e-caprolactama se obtiene el producto "poliamida 6" técnicamente utilizado a menudo, mientras que mediante polimerización por apertura del anillo de laurin-lactama se obtiene la "poliamida 12" técnicamente asimismo importante. También copolímeros a base de lactamas tales como, por ejemplo, copolímeros a base de e-caprolactama y laurin-lactama ("poliamida 6/12") son de gran importancia técnica.

La preparación de e-caprolactama tiene lugar habitualmente mediante reacción de ciclohexanona con el hidrógeno- sulfato o el hidrocloruro de la hidroxilamina bajo formación de ciclohexanonoxima. Ésta se transforma en e- caprolactama mediante la reacción de transposición de Beckmann, empleándose a menudo ácido sulfúrico concentrado en calidad de catalizador. La preparación de la ciclohexanona tiene lugar habitualmente mediante oxidación catalítica de ciclohexano con oxígeno del aire, obteniéndose ciclohexano de nuevo mediante hidrogenación de benceno.

Particularmente compleja es la preparación de laurin-lactama. Esta tiene lugar a gran escala, debido a que primeramente se trimeriza butadieno bajo formación de ciclododecatrieno. A continuación, el ciclododecatrieno se hidrogena bajo formación de ciclododecano, y el ciclododecano, así obtenido, se oxida con formación de ciclododecanona. La ciclododecanona obtenida de esta manera se hace reaccionar acto seguido con hidroxilamina para dar ciclododecanoxima, que luego se transforma en laurin-lactama en una reacción de transposición de Beckmann.

El inconveniente de estos procedimientos conocidos del estado de la técnica para la preparación de lactamas mediante transposición de Beckmann de oximas estriba, entre otros, en que como producto secundario se forman grandes cantidades de sales tales como, por ejemplo, sulfato de sodio, que deben ser eliminadas. Por lo tanto, en el estado de la técnica se describen también otros procedimientos para la preparación de lactamas que no presentan estos inconvenientes. Así, el documento EP-A-0 748 797 describe un procedimiento para la preparación de lactamas a partir de dinitrilos, en el que el dinitrilo se hidrogena para formar aminonitrilo y el aminonitrilo se hace reaccionar mediante hidrólisis ciclante para formar lactama. Como catalizador para la hidrólisis ciclante se dan a conocer tamices moleculares tales como zeolitas de carácter ácido, silicatos y tamices moleculares no zeolíticos, fosfatos de metales y óxidos de metales u óxidos mixtos de metales. Este procedimiento presenta, sin embargo, entre otros, el inconveniente de que la selectividad de la reacción del aminonitrilo mediante la hidrólisis ciclante es más bien escasa y, por lo tanto, se forman grandes cantidades de productos secundarlos. Además de ello, en el caso de los procedimientos para la preparación de lactamas, descritos de este estado de la técnica, se emplean hidrocarburos tales como benceno o butadieno que se obtienen mediante craqueo de bencina o petróleo y que, por lo tanto, no se derivan de materias primas renovables. La preparación de poliamidas que se basan en lactamas preparadas de este modo se ha de considerar, por lo tanto, como desventajosa desde un punto de vista ecológico.

La presente invención tenía por misión superar los inconvenientes que resultan del estado de la técnica.

En particular, la presente invención tenía por misión indicar un procedimiento con el que se puedan formar lactamas, en particular laurin-lactama, en el menor número posible de etapas de procedimiento y bajo formación de los menos productos secundarios posibles.

Además, era misión de la presente invención indicar un procedimiento con el que se puedan preparar lactamas, en particular laurin-lactama a partir de materias primas renovables.

Una contribución para resolver los problemas precedentemente mencionados la ofrece una célula que ha sido modificada mediante tecnología genética con respecto a su tipo salvaje de modo que, en comparación con su tipo salvaje, es capaz de producir más ácidos ro-aminocarboxílicos, ásteres de ácidos tu-aminocarboxílicos o más lactamas derivadas de ácidos tu-aminocarboxílicos a partir de ácidos carboxílicos o ásteres de ácidos carboxílicos, presentando la célula una actividad, incrementada en comparación con su tipo salvaje, de las enzimas E¡ y Em o de las enzimas E¡, En y Em:

i) de una enzima E¡ que cataliza la reacción de ácidos carboxílicos o ásteres de ácidos carboxílicos para dar los correspondientes ácidos ro-hidroxicarboxílicos o ásteres de ácidos tu- hidroxicarboxílicos, elegida del grupo consistente en las alcano monooxigenasas: alcano monooxigenasa codificada por a/kBGÍ de Pseudomonas puf/da GPo1 y citocromo-P450- monooxigenasas de Candida fropica/is;

¡i) de una enzima En que cataliza la reacción de ácidos tu-hidroxicarboxílicos o ásteres de ácidos tu- hidroxicarboxílicos para dar los correspondientes ácidos tu-oxocarboxílicos o ásteres de ácidos tu- oxocarboxílicos, elegida del grupo consistente en las alcoholdeshidrogenasas codificadas por el gen a/kJ;

¡i) de una enzima Em que cataliza la reacción de ácidos tu-oxocarboxílicos o ásteres de ácidos tu- oxocarboxílicos para dar los correspondientes ácidos tu-aminocarboxílicos o ásteres de ácidos tu- aminocarboxílicos, elegida del grupo de las ro-transaminasas.

Una célula de este tipo se puede emplear con el fin de producir ácidos tu-aminocarboxílicos, ásteres de ácidos tu- amlnocarboxíllcos o bien lactamas derivadas de ácidos ro-aminocarboxílicos por vía fermentativa a partir de ácidos carboxílicos o ásteres de ácidos carboxílicos, por ejemplo a partir de ácido láurico o ásteres del ácido láurico.

La formulación "que, en comparación con su tipo sa/va/'e, es capaz de producir más ácidos ro-aminocarboxi/icos, ásteres de ácidos (v-aminocarboxi/icos o más /acfamas derivadas de ácidos m-aminocarboxi/icos a partir de ácidos carboxi/icos o ásteres de ácidos carboxi/icos" se refiere también al caso de que el tipo salvaje de la célula modificada por tecnología genética no sea capaz de formar en absoluto ácidos uj-aminocarboxílicos, ásteres de ácidos u-amlnocarboxíllcos o lactamas derivadas de ácidos oo-aminocarboxílicos, pero al menos ninguna cantidad detectable de estos compuestos, y sólo después de la modificación por tecnología genética, se pueden formar cantidades detectables de estos componentes.

Por un "tipo sa/va/'e" de una célula se designa preferiblemente una célula, cuyo genoma se presenta en un estado como el que se ha formado de modo natural por la evolución. La expresión se utiliza tanto para la célula completa como también para genes Individuales. Por lo tanto, bajo la expresión "tipo sa/va/e" no están incluidas, en particular, aquellas células o bien aquellos genes cuyas secuencias génlcas han sido modificadas, al menos en parte, por el hombre mediante procedimientos recomblnantes.

En este caso, de acuerdo con la Invención se prefiere que la célula modificada por tecnología genética sea modificada por tecnología genética de manera que en un Intervalo de tiempo definido, preferiblemente en el espacio de 2 horas, todavía más preferiblemente en el espacio de 8 horas y lo más preferiblemente en el espacio de 24 horas, forme al menos 2 veces, de manera particularmente... [Seguir leyendo]

1. Una célula que ha sido modificada mediante tecnología genética con respecto a su tipo salvaje de modo que, en comparación con su tipo salvaje, es capaz de producir más ácidos m-amlnocarboxílicos, ásteres de ácidos ro- amlnocarboxíllcos o más lactamas derivadas de ácidos ro-aminocarboxíllcos a partir de ácidos carboxíllcos o ásteres de ácidos carboxíllcos, presentando la célula una actividad, Incrementada en comparación con su tipo salvaje, de las enzimas E¡ y Em o de las enzimas E¡, En y Em:

I) de una enzima E¡ que cataliza la reacción de ácidos carboxíllcos o ásteres de ácidos carboxíllcos

para dar los correspondientes ácidos ro-hldroxlcarboxíllcos o ásteres de ácidos ro- hldroxicarboxíllcos, elegida del grupo consistente en las alcano monooxlgenasas: alcano monooxlgenasa codificada por a//(BG7 de Pseudomonas puf/da GPo1 y cltocromo-P450- monooxlgenasas de Cand/da frop/ca//s;

¡I) de una enzima En que cataliza la reacción de ácidos co-hldroxlcarboxíllcos o ásteres de ácidos oo- hldroxicarboxíllcos para dar los correspondientes ácidos u-oxocarboxíllcos o ásteres de ácidos oo- oxocarboxíllcos, elegida del grupo consistente en las alcoholdeshldrogenasas codificadas por el gen a//rJ;

¡II) de una enzima Em que cataliza la reacción de ácidos ro-oxocarboxíllcos o ásteres de ácidos oo- oxocarboxíllcos para dar los correspondientes ácidos ro-amlnocarboxíllcos o ásteres de ácidos (*)- amlnocarboxíllcos, elegida del grupo de las co-transaminasas.

2. La célula según la reivindicación 1, en donde la enzima E¡ es la alcano monooxlgenasa codificada por a//rBG7 de Pseudomonas puf/da GPo1.

3. La célula según la reivindicación 1 ó 2, en donde la enzima En es codificada por el gen a//(J de Pseudomonas puf/da GPo1.

4. La célula según una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la enzima Em es la ro-transaminasa CV2025 de C/?romoóacfer/um v/o/aceum DSM30191.

5. La célula según una de las reivindicaciones precedentes, en donde en la célula está incrementada la expresión de una enzima E¡v que cataliza la reacción de ásteres de ácidos (u-oxocarboxílicos para dar los correspondientes ácidos üo-amlnocarboxílicos.

6. La célula según la reivindicación 5, en donde la enzima E¡v es la lipasa LipA (Q76D26) de Pseudomonas f/uorescens que es secretada por la célula.

7. La célula según una de las reivindicaciones precedentes, en donde en la célula está incrementada la expresión de una enzima Ev que cataliza la reacción de ácidos (o-oxocarboxílicos para dar las correspondientes lactamas.

8. La célula según la reivindicación 7, en donde la enzima Ev es secretada por la célula.

9. La célula según una de las reivindicaciones precedentes, en donde la célula es una célula de Escdedcd/a co// modificada por tecnología genética, una célula de Co/yneóacfer/um g/ufam/cum modificada por tecnología genética o una célula de Pseudomonas puf/da modificada por tecnología genética.

10. Un procedimiento para la preparación de ácidos ru-aminocarboxílicos, de ásteres de ácidos (u-aminocarboxílicos o de lactamas derivadas de ácidos tu-aminocarboxílicos, que contiene las etapas de procedimiento:

I) poner en contacto una célula de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 con un medio de cultivo que contiene un ácido carboxílico o un áster de ácido carboxílico, o con un medio de cultivo contiguo a una fase orgánica que contiene un ácido carboxílico o un áster de ácido carboxílico bajo condiciones que posibilitan a la célula a formar, a partir del ácido carboxílico o a partir de los ásteres de ácido carboxílico, ácidos ru- aminocarboxílicos, ásteres de ácidos ro-aminocarboxílicos o lactamas derivadas de ácidos ru- aminocarboxílicos;

II) eventualmente, aislamiento de los ácidos uj-aminocarboxílicos, de los ásteres de ácidos ru-

aminocarboxílicos o de las lactamas derivadas de ácidos tu- aminocarboxílicos formados.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en donde los ásteres de ácidos ro-aminocarboxílicos formados en la etapa I) del procedimiento se hacen reaccionar, en una etapa adicional del procedimiento, con procedimientos químicos convencionales para dar ácidos uj-aminocarboxílicos.

12. El procedimiento según la reivindicación 10 u 11, en el que la célula es una célula de Esc/7er/c/7/a co// modificada por tecnología genética, una célula de Coryneóacfer/um g/ufam/cum modificada por tecnología genética o una célula de Pseudomonas puf/da modificada por tecnología genética.

13. El procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el medio de cultivo empleado en la etapa I) del procedimiento contiene aminoácidos que actúan de donantes de amina en la reacción, catalizada por transamlnasa, de los ácidos cu-aminocarboxílicos o de los ásteres de ácidos (jj-aminocarboxílicos para dar los correspondientes ácidos oo-aminocarboxílicos o ásteres de ácidos uj-aminocarboxílicos.

14. El procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el procedimiento se lleva a cabo en un sistema bifásico que contiene

A) una fase acuosa, así como

B) una fase orgánica,

en donde la formación de los ácidos cu-aminocarboxílicos, de los ásteres de ácidos cu-aminocarboxílicos o de las lactamas derivadas de ácidos cu-aminocarboxílicos por parte de las células en la etapa I) del procedimiento tiene lugar en la fase acuosa, y los ácidos cu-aminocarboxílicos formados, los ásteres de ácidos uj-aminocarboxílicos formados o las lactamas derivadas de ácidos (u-aminocarboxílicos formadas se acumulan en la fase orgánica.

15. El procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 14, en el que el aislamiento de los ácidos cu- aminocarboxílicos formados, de los ásteres de ácidos cu-aminocarboxílicos formados o de las lactamas derivadas de ácidos cu-aminocarboxílicos formadas tiene lugar a través de un procedimiento de purificación de al menos dos etapas, que comprende

a) una etapa de extracción, en la que se extraen del medio de cultivo los ácidos (u-aminocarboxílicos, los ásteres de ácidos co-aminocarboxílicos o las lactamas derivadas de ácidos (u-aminocarboxílicos, así como

b) una etapa de purificación fina, en la que el extracto obtenido en la etapa a) del procedimiento se purifica adicionalmente a través de procedimientos de destilación o de otros procedimientos de extracción, obteniéndose una fase de ácido tu-aminocarboxílico, una fase de áster de ácido (u-aminocarboxílico o una fase de lactama con una pureza de al menos 99,8%.

16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que en el caso de la extracción en la etapa a) del procedimiento se trata de una extracción reactiva.

17. El procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 16, en el que el ácido carboxílico es ácido láurico o el áster de ácido carboxílico es áster metílico del ácido láurico, y en el que el ácido láurico o el áster metílico del ácido láurico se hace reaccionaren la etapa II) del procedimiento para formar laurln-lactama.

18. Un procedimiento para la preparación de pollamldas basadas en ácidos u-aminocarboxílicos, que comprende las etapas de procedimiento:

(a1) preparación de ácidos oo-aminocarboxílicos mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 10a 17;

(a2) polimerización del ácido cu-aminocarboxílico, obteniéndose una pollamlda.

19. Un procedimiento para la preparación de pollamldas basadas en lactamas, que comprende las etapas de procedimiento:

()31) preparación de lactamas mediante el procedimiento según una de las reivindicaciones 10 a 17;

()32) polimerización con apertura del anillo o policondensación de la lactama, obteniéndose una poliamida.