Células productoras de polipéptidos.

Método de selección de una célula eucariótica expresante de una inmunoglobulina,

en el que el método comprende: a) transfectar una célula eucariótica con un ácido nucleico que comprende,

en dirección 5' a 3',

i) un primer ácido nucleico codificante de por lo menos un fragmento de un dominio CH3 o CH4 de cadena pesada de inmunoglobulina sin codón de parada traduccional dentro del marco,

ii) un segundo ácido nucleico que se inicia con el sitio 5' donante de procesamiento de un dominio CH3 o CH4 de cadena pesada de inmunoglobulina y que termina en el sitio 3' aceptor de procesamiento del exón M1 de dominio transmembranal de cadena pesada de inmunoglobulina posterior que comprende un codón de parada traduccional dentro del marco y una señal de poliadenilación,

iii) un tercer ácido nucleico codificante de: iiia) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal de inmunoglobulina,

b) cultivar dicha célula transfectada bajo condiciones adecuadas a la producción de pre-ARNm de dicho ácido nucleico, procesar dicho pre-ARNm, y traducción de dicho ARNm procesado en una inmunoglobulina, en la que dicha célula transfectada produce inmunoglobulina soluble e inmunoglobulina unida a membrana plasmática mediante procesamiento alternativo de dicho pre-ARNm y

c) seleccionar una célula con inmunoglobulina unida a membrana plasmática que será la célula expresante de una inmunoglobulina.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10154684.

Solicitante: HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Inventor/es: TIEFENTHALER, GEORG, ENDL, JOSEF, KOPETZKI, ERHARD, PLOETTNER,OLIVER DR, SCHWARZ,URSULA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K16/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.
  • C07K16/06 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › del suero.
  • C12N15/85 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células animales.

PDF original: ES-2543629_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Células productoras de polipéptidos

La presente invención se refiere al campo de la producción de polipéptidos. Describe un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico alternativamente procesable, células que comprenden dicho ácido nucleico, un método de aislamiento de células que expresan un polipéptido heterólogo, que utiliza un ácido nucleico que comprende un primer ácido nucleico codificante de un polipéptido heterólogo, un segundo ácido nucleico que comprende un ácido nucleico alternativamente procesable, y un tercer ácido nucleico codificante de por lo menos un fragmento de un dominio transmembrana o un péptido de señal para un anclaje GPI, y además un método para la producción de polipéptidos heterólogos.

Antecedentes de la invención

Los sistemas de expresión para la producción de polipéptidos recombinantes son bien conocidos del estado de la técnica y se describen en, por ejemplo, Marino M.H., Biopharm. 2:18-33, 1989; Goeddel D.V. ef a/., Methods Enzymol. 185:3-7, 1990; Wurm F. y Bernard A., Curr. Opin. Biotechnol. 10:156-160, 1999. Para la producción de polipéptidos y proteínas utilizados en aplicaciones farmacéuticas, preferentemente se utilizan células huésped de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NS0, células Sp2/0, células COS, células HEK, células PER.C6@ y similares. El ácido nucleico codificante del polipéptido preferentemente se introduce en la célula huésped comprendida en un ácido nucleico, tal como, por ejemplo, un vector de expresión. Los elementos esenciales de un vector de expresión son una unidad de propagación plasmídica procariótica, por ejemplo Esc/?er/c/?/a co// que comprende un origen de replicación y un marcador de selección, un marcador de selección eucariótico y uno o más casetes de expresión para la expresión del gen o genes estructurales de interés, comprendiendo cada uno un promotor, un gen estructural y un terminador de transcripción, incluyendo una señal de poliadenilación. Para la expresión transitoria en células de mamífero puede incluirse un origen de replicación de mamífero, tal como el Ori de SV40 o el OriP del VEB. Como promotor puede seleccionarse un promotor constitutivo o inducible. Para la transcripción optimizada puede incluirse una secuencia de Kozak en la región 5' no traducida. Para el procesamiento del ARNm, en particular pueden incluirse señales de terminación de transcripción y de procesamiento pre-ARNm y de procesamiento de ARNm, según la organización del gen estructural (organización exón-intrón), así como una señal de poliadenilación.

La expresión de un gen se lleva a cabo en forma de expresión transitoria o permanente. El polipéptido o polipéptidos de interés pueden ser un polipéptido secretado, que contiene una extensión N-terminal (también conocida como la secuencia de señal), que resulta necesaria para el transporte/secreción del polipéptido a través de la célula y hacia el medio extracelular, o puede ser un polipéptido citosólico.

Para la producción a gran escala de un polipéptido, debe establecerse una línea celular de alta producción. Tras la transfección de una línea celular huésped, tal como células CHO, células NS0, células Sp2/0, células BHK, células COS, células PER.C6@ o células HEK, en general se obtiene una pluralidad de clones con diferentes características debido a, por ejemplo, las grandes diferencias entre los polipéptidos expresados a partir de plásmidos transitoriamente transfectados o de plásmidos establemente integrados. Para los fines de selección, el ácido nucleico introducido en las células presenta adicionalmente un marcador seleccionable, por ejemplo un gen que confiere resistencia frente a una sustancia de otro modo letal.

Tras la transfección y mediante el crecimiento en un medio de selección apropiado, debe aislarse un clon de producción elevada. Resulta laborioso y en consecuencia caro. Se han desarrollado varios métodos para resolver este problema.

Uno de estos métodos es la amplificación génica. En ella, las células deficientes en enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) se transfectan con un vector/plásmido que contiene un primer casete de expresión para la expresión de la proteína DHFR y un segundo casete de expresión para la expresión de un polipéptido heterólogo de interés. Mediante la utilización de un medio de cultivo empobrecido en glicina, hipoxantina y timidina, se establecen condiciones de crecimiento selectivas. Para la amplificación se añade un inhibidor de DHFR, el metotrecato (MTX) (Kaufman R.J. ef a/., J. Mol. Biol. 159:601-621, 1982; patente US n° 4.656.134).

Alternativamente pueden fusionarse moléculas informadoras, tales como la cloranfenicol-acetil-transferasa, la luciferasa, la proteína fluorescente verde o la beta-galactosidasa, con el polipéptido heterólogo para el que se desea una línea celular de alta producción y se utiliza como marcador de selección indirecto. La selección tiene lugar en presencia de un sustrato exógeno o cofactor añadido.

Un método adicional para la identificación de un clon de alta producción es la transcripción ligada de un gen marcador seleccionable y un gen estructural codificante de un polipéptido heterólogo mediante un sitio interno de entrada ribosómica (SIER). Con este diseño, la expresión del polipéptido heterólogo puede correlacionarse con la expresión del marcador seleccionable.

Las ¡nmunoglobulinas humanas son producidas por linfocitos especializados, las células B. Estas células no sólo secretan ¡nmunoglobulinas (lg_s), sino que también presentan ¡nmunoglobulinas sobre sus membranas celulares externas en forma de ¡nmunoglobulinas unidas a la membrana plasmática (lg_m). Estas lg_m desempeñan un papel importante en el inicio de una respuesta inmunológica. Las ¡nmunoglobulinas unidas a membrana plasmática presentadas presentan la función de receptores celulares de su antígeno correspondiente.

Desde 1980 se han publicado artículos referentes al origen de las formas secretada y unida a membrana plasmática de las ¡nmunoglobulinas. Early ef a/. (Early, P., ef a/., Cell 20:313-319, 1980) han informado de que en ratones dos especies de ARNm que codifican para la cadena pesada de las ¡nmunoglobulinas se originan en el mismo transcrito primario de un único gen de ¡nmunoglobulina m. La formación de las formas secretadas (lg_s) y unidas a membrana plasmática (lg_m) resultan del procesamiento alternativo del pre-ARNm de cadena pesada. Para la ¡soforma lg_s todos los exones codificantes de los dominios de la ¡nmunoglobulina y el intrón posterior al exón codificante del dominio C-terminal se encuentran conservados en el ARNm y la señal de poliadenilación situada después del codón de parada en el intrón se utiliza para el corte y poliadenilación del transcrito primario. Para la ¡soforma lg_m un sitio 5' donante alternativo después del exón codificante del dominio C-terminal de la forma secretada (es decir, CH3 o CH4, respectivamente) une la región constante con los exones posteriores M1 y M2 codificantes de un dominio transmembranal. En este caso, la secuencia codificante de los aminoácidos terminales y el codón de parada de la forma secretada, así como la señal de poliadenilación intrónica contigua para la forma lg_s son eliminados por el procesamiento conjuntamente con el intrón.

Por ejemplo, la proporción entre el ARNm codificante de la forma cadena pesada de ¡nmunoglobulina secretada y el ARNm codificante de la forma cadena pesada de ¡nmunoglobulina unida a membrana plasmática es de entre 10:1 y 100:1. Esta proporción se establece principalmente durante el procesamiento pre-ARNm. Los mecanismos de control traduccional y post-traduccional contribuyen sólo una parte menor (ver, por ejemplo, Xiang S.D. ef a/., Immun. Cell Biol. 79:472-481, 2001).

La ¡nmunoglobulina unida a la membrana plasmática de la célula presenta la misma secuencia de aminoácidos y estructura secundaria que su análogo secretado. La diferencia es una extensión C-terminal de la cadena pesada de lg_s que comprende un dominio transmembranal. Este dominio transmembranal presenta en general una longitud de entre aprox. 40 y aprox. 75 residuos aminoácidos. Para las ¡nmunoglobulinas murina y humana, el dominio transmembranal puede subdividirse en tres regiones estructurales diferentes: una región extracelular N-term¡nal de entre 13 y 67 residuos aminoácidos, un tramo transmembranal conservado central de 25 residuos aminoácidos y una región citoplasmática C-terminal de entre 3 y 28 residuos aminoácidos (Major J.G. ef a/., Mol. Immunol. 33:179- 187, 1996).

Los vectores de expresión que comprenden un gen seleccionare amplificable, un gen proteína fluorescente y un gen codificante... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método de selección de una célula eucariótica expresante de una inmunoglobulina, en el que el método comprende:

a) transfectar una célula eucariótica con un ácido nucleico que comprende, en dirección 5' a 3',

i) un primer ácido nucleico codificante de por lo menos un fragmento de un dominio CH3 o CH4 de cadena pesada de inmunoglobulina sin codón de parada traduccional dentro del marco,

¡i) un segundo ácido nucleico que se inicia con el sitio 5' donante de procesamiento de un dominio CH3 o CH4 de cadena pesada de inmunoglobulina y que termina en el sitio 3' aceptor de procesamiento del exón M1 de dominio transmembranal de cadena pesada de inmunoglobulina posterior que comprende un codón de parada traduccional dentro del marco y una señal de poliadenilación, i¡¡) un tercer ácido nucleico codificante de:

¡¡¡a) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal de inmunoglobulina,

b) cultivar dicha célula transfectada bajo condiciones adecuadas a la producción de pre-ARNm de dicho ácido nucleico, procesar dicho pre-ARNm, y traducción de dicho ARNm procesado en una inmunoglobulina, en la que dicha célula transfectada produce inmunoglobulina soluble e inmunoglobulina unida a membrana plasmática mediante procesamiento alternativo de dicho pre-ARNm y

c) seleccionar una célula con inmunoglobulina unida a membrana plasmática que será la célula expresante de una inmunoglobulina.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho segundo ácido nucleico se obtiene del ácido nucleico codificante de un polipéptido o proteína seleccionado de entre el grupo que comprende el receptor C3b/C4b, el RFCE humano, de pollo y de rata, el RFCF, la cadena pesada de las inmunoglobulinas ct, s, y y p humanas y de ratón, el receptor de PLA2 humano, Cek5 de pollo y la cadena a del receptor del factor inhibidor de leucemia de ratón.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que únicamente un intrón del pre- ARNm producido puede procesarse alternativamente.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicha selección de una célula se lleva a cabo mediante un método seleccionado de entre el grupo de citometria de flujo, ELISA, inmunoprecipitación, cromatografía de columna de ¡nmunoafinidad, separación mediante inmunoafinidad con perlas magnéticas, métodos de aislamiento basados en microscopía o unión inmunológica.


 

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