Anticuerpos contra el receptor de la EPO humana.

Anticuerpo de unión al receptor de EPO humana, caracterizado por la unión específica al fragmento de receptor de EPO GLSDGPYSNPYENSLIP (SEC ID nº 26) que comprende un residuo fosfo-tirosilo en la posición 465,

en el que el anticuerpo se une específicamente a receptor de EPO humana activado y discrimina entre EPO-R no activado y activado, el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEC ID nº 17, una región CDR2 de SEC ID nº 18 y una región CDR1 de SEC ID nº 19 y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEC ID nº 20, una región CDR2 de SEC ID nº 21 y una región CDR1 de SEC ID nº 22, y en el que el anticuerpo se une específicamente a pY465 en ensayo ELISA en una proporción S/R de 10 ó superior a una concentración de anticuerpo de 0,1 μg/ml.

Anticuerpos contra el receptor de la EPO humana Antecedentes de la invención

La eritropoyetina (EPO) humana es una glucoproteína de 166 aminoácidos (aa) que participa en la proliferación y diferenciación de las células progenitoras eritroides. Estas respuestas celulares están mediadas por el receptor de la EPO humana (EPO-R), una glucoproteína de 58 aa. El receptor de la EPO humana (EPO-R) es una proteína de 58 aminoácidos de longitud (Swiss Prot P19235) quecontiene un único dominio transmembranal y que ha sido clasificada como miembro de la subfamilia de receptores de cltoquina de clase I de las hormonas de crecimiento. El EPO-R ha sido descrito en, por ejemplo, Winkelmann J.C. et al., Blood 76:24-3, 199, y Jones S.S. et al., Blood 76:31-35, 199. La activación de EPO-R se produce mediante dimerización (Matthews D.J., PNAS 93:9471-9476,

1996). EPO-R comprende ocho sitios de tirosina cltoplasmátlcos que resultan fosforilados tras la estimulación con EPO (Li K. et al., J. Biol. Chem. 278:472-479, 23; Wu H. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:186-181,

1997) , resultando en "EPO-R activado".

Los anticuerpos contra EPO-R son conocidos a partir de, por ejemplo, Andrea A.D., Blood 82:46-52, 1993; Elliott S., Blood 17:1892-1895, 26; KirkebyA., J. Neroscl. 164:5-58, 27; Miura, O., Arch. Biochem. 36 (1993)2-28; and EP 1 146 56, EP 1 327 681, EP 773 962, EP 776 37, US 22/3186, US 23/215444, US 24/58393, US 24/71694, US 24/175379, US 25/227289, US 25/24449, US 26/1892, US 6.998.124, US 7.53.184, US 7.81.523, WO 1995/5469, WO 1996/3438, WO 2/61637, WO 24/3563 A2, WO 25/143 A2. Sin embargo, es conocido a partir del estado de la técnica que los anticuerpos conocidos contra EPO-R no son capaces de discriminar entre EPO-R no activado y activado (ver Jelkmann W. et al., Crit. Rev. Onc./Hematol. 67:39-61, 28; Li K. et al., J. Biol. Chem. 278:472-479, 23, yWu, H. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:186-181, 1997).

Barber D. L. ef al. Informan de que un el transductor de señales activado y activador de transcripción S (STAT5) y el receptor de eritropoyetina fosforilado presentan un epítopo común a ambos, con implicaciones para el modelo de anclaje de activación de STAT (Blood 97:223-2237, 21).

Sytkowski A.J. informan de la biología de los receptores y la transducción de señales de la eritropoyetina (Erythropoietin, WILEYVCH VERLAG GMBH & CO. KGAA, Weinheim, Alemania, páginas 73 a 1, 24).

Damen J.E. et al. informan de que la fosforilación de la tirosina 53 en el receptor de eritropoyetina (EpR) resulta esencial para la unión de la subunidad P85 de la fosfatidil-inositol (Pl) 3-quinasa y para la actividad de la Pl 3- quinasa asociada al EpR (J. Biol. Chem. 27:2342-2348, 1995).

Miller B.A. et al. informan de la identificación del dominio de receptor de eritropoyetina necesario para la activación de los canales del calcio (J. Biol. Chem. 274:2465-2472).

Arai A. et al. informan de que CrkL es atraído mediante su dominio SH2 al receptor de eritropoyetina y desempeña un papel en la señalización de receptores mediada por Lyn (J. Biol. Chem. 276:33282-3329, 21).

Wu H. et al. informan de que la interacción funcional entre la eritropoyetina y los receptores de factores de células madre resulta esencial para la formación de colonias eritroides (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:186-181, 1997).

Bergelson S. et al. informan de que los residuos de tirosina dentro del dominio intracelular del receptor de eritropoyetina son intermediarios de la activación de los factores de transcripción AP-1 (J. Biol. Chem. 273:2396- 241, 1998).

El anticuerpo monoclonal de conejo anti-EpoR fosfo (pY485) se encuentra disponible comercialmente de Epitomics Inc. (número de cat. 2585-1).

Descripción resumida de la invención

La invención comprende un anticuerpo de unión específica a receptor de EPO humana activado y la discriminación entre EPO-R no activado y activado, lo que permite el análisis específico de la activación de EPO-R, especialmente en células y biopsias procedentes de tejido humano.

La invención comprende un anticuerpo, caracterizada por la unión específica del fragmento de receptor de EPO humana GLSDGPYSNPYENSLIP (SEC ID n° 26), que comprende un residuo fosfotirosilo en la posición 465 (subrayado).

La numeración se refiere a la secuencia de aminoácidos del receptor de EPO de UniProtKB/Swiss-Prot P19235 sin péptido de señal.

Un anticuerpo según la invención no se une al fragmento de receptor de EPO humana GLSDGPYSNPYENSLIP (SEC ID n° 26) sin un residuo fosfotirosilo en la posición 465.

Un anticuerpo según la invención se une específicamente a receptor de EPO (activado) fosforilado en lisados de células UT7, las cuales expresan EPO-R en una cantidad de entre 1. y 5. receptores por cada célula (células que expresan EPO-R) y que se tratan con 5 pM de EPO para la activación. Un anticuerpo según la invención no se une a receptor de EPO en lisados de células UT7 que expresan receptor de EPO y que no se tratan con EPO. Dicha unioón puede medirse mediante transferencia western.

El anticuerpo se caracteriza porque el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de secuencia SEC ID n° 17, una reglón CDR2 de secuencia SEC ID n° 18 y una región CDR1 de secuencia SEC ID n° 19 yt porque el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de secuencia SEC ID n° 2, una reglón CDR2 de la secuencia SEC ID n° 21 y una región CDR1 de la secuencia SEC ID n° 22.

El anticuerpo se caracteriza porque el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia SEC ID n° 23, y el dominio variable de cadena ligera es la secuencia SEC ID n° 24.

Preferentemente el anticuerpo según la invención se caracteriza por la unión a EPO-R con una afinidad de unión de por lo menos 1'® M'1 a 1'12 M'1.

Las cadenas constantes humanas y otras cadenas constantes son bien conocidas del estado de la técnica y por ejemplo han sido descritas por Kabat (ver, por ejemplo, Johnson G. y Wu T.T., Nucleic Acids Res. 28:214-218, 2). Resulta preferente además que el anticuerpo se obtenga del ratón y comprenda un marco de secuencia variable del anticuerpo procedente de un anticuerpo de ratón según Kabat (ver, por ejemplo, Johnson G. y Wu T.T., Nucleic Acids Res. 28:214-218, 2).

El anticuerpo según la Invención preferentemente se obtiene de ratón, conejo o ser humano. Resulta preferente como anticuerpo humano el isotipo lgG1.

En la presente memoria se proporcionan vectores de expresión que contienen ácidos nucleicos capaces de expresar dichos ácidos nucleicos en una célula huésped procariótica o eucariótica, y células huésped que contienen dichos vectores para la producción recombinante de dicho anticuerpo.

En la presente memoria se proporciona una célula huésped procariótica o eucariótica que comprende un vector tal como se proporciona en la presente memoria.

En la presente memoria se proporciona un método para la producción de un anticuerpo humanizado o humano recombinante según la invención, caracterizado porque se expresa un ácido nucleico tal como se proporciona en la presente memoria en una célula huésped procariótica o eucariótica y se recupera dicho anticuerpo a partir de dicha célula o del sobrenadante del cultivo celular.

La invención comprende además la utilización de un anticuerpo según la invención con el fin de determinar/detectar células de mamífero que portan/expresan receptor de EPO activado.

Se utiliza un anticuerpo según la invención para determinar el receptor de EPO activado en lisados de biopsias de muestras de tejido humano. Preferentemente dicha detección se lleva a cabo mediante transferencia western.

Descripción detallada de la invención

El término "anticuerpo" comprende las diversas formas de estructura de anticuerpo, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, anticuerpos completos y fragmentos de anticuerpo.

La expresión "fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo de longitud completa, preferentemente el dominio variable del mismo, o por lo menos el sitio de unión de antígeno del mismo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen diacuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos. Los anticuerpos scFv se describen, por ejemplo, en Houston J.S., Methods in Enzymol. 23:46-88, 1991. Además, los fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos de cadena sencilla que presentan las características de un dominio VH, es decir la capacidad de ensamblarse con un dominio Vl, o de un dominio Vl, es decir la capacidad de ensamblarse

conjuntamente con un dominio Vh con un sitio de... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo de unión al receptor de EPO humana, caracterizado por la unión especifica al fragmento de receptor de EPO GLSDGPYSNPYENSLIP (SEC ID n° 26) que comprende un residuo fosfo-tirosilo en la posición

465, en el que el anticuerpo se une específicamente a receptor de EPO humana activado y discrimina entre EPO-R

no activado y activado, el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 de SEC ID n° 17, una región CDR2 de SEC ID n° 18 y una región CDR1 de SEC ID n° 19 y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 de SEC ID n° 2, una región CDR2 de SEC ID n° 21 y una región CDR1 de SEC ID n° 22, y en el que el anticuerpo se une específicamente a pY465 en ensayo ELISA en una proporción S/R de 1 ó 1 superior a una concentración de anticuerpo de ,1 pg/ml.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado por que el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia SEC ID n° 23, y el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia SEC ID n° 24.

3. Utilización de un anticuerpo según las reivindicaciones 1 a 2 para la determinación de receptor de EPO activado en células, tejidos y biopsias humanas.

4. Utilización según la reivindicación 3, caracterizada por que la muestra es un lisado de tejido humano.

5. Utilización según la reivindicación 4, caracterizada por que la determinación se lleva a cabo mediante transferencia western o ELISA.