Anticuerpos cargados parcialmente y métodos para su conjugación.

Un método de conjugación de un fármaco a un anticuerpo que da lugar a selectividad en la colocación del fármaco,

que comprende:

reducir totalmente el anticuerpo con un agente reductor;

tratar el anticuerpo totalmente reducido con cantidades limitantes de un agente reoxidante para volver a formar al menos un enlace disulfuro intercatenario del anticuerpo, de modo que queden al menos dos tioles intercatenarios; y

conjugar el fármaco a los tioles intercatenarios.

Anticuerpos cargados parcialmente y métodos para su conjugación Antecedentes

La presente divulgación se dirige a proteínas modificadas que tienen al menos un punto de conjugación con, por ejemplo, un fármaco que genera isómeros específicos del conjugado de proteína-fármaco, y a métodos para dicha conjugación que genera los isómeros específicos. Se dirige además a anticuerpos a los que se pueden conjugar agentes citotóxicos y/o agentes citostáticos, dando lugar a isómeros específicos, y a métodos para su conjugación.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) son una valiosa arma en la batalla contra el cáncer. Los mAb también se usan en el tratamiento de trastornos inmunes. Para seguir avanzando en el uso de terapias basadas en mAb contra el cáncer y los trastornos inmunes, se ha explorado una serie de nuevas metodologías. Una metodología es aumentar el potencial citotóxico de los mAb contra las células tumorales mediante la unión de cargas útiles de destrucción celular. Se han conjugado moléculas tales como toxinas, radionúclidos, proteínas y fármacos contra el cáncer a ciertos mAb para generar inmunotoxinas, radioinmunoconjugados y conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), respectivamente.

Los factores que se han considerado previamente en el desarrollo de ADC han incluido la elección del anticuerpo y la optimización de la potencia del componente de fármaco, la estabilidad del enlazador y el método mediante el que el fármaco se une covalentemente al mAb. La convención común para la producción de ADC conjugados a través de los enlaces disulfuro ha sido mediante la reducción de todos los enlaces disulfuro intercatenarios de un anticuerpo y la reacción de todos los tioles de mAb reducidos con un compuesto capaz de la interaccionar con todos los tioles reducidos, formando ADC uniformemente sustituidos con 8 fármacos/mAb, es decir, "completamente cargados", sin la capacidad de obtenerse especificidad para un determinado sitio de conjugación.

Por ejemplo, el antígeno CD3 se expresa a un alto nivel en cánceres tales como la enfermedad de Hodgkin (EH) y los linfomas anaplásicos de células grandes (LACG). Esta expresión de CD3, junto con la expresión limitada en las células normales, lo convierte en una atractiva diana para la terapia con ADC. El mAb quimérico dirigido a CD3, cAC1, tiene actividad antitumoral contra la EH tanto in vitro como en modelos de xenoinjerto de ratón SCID subcutáneos y difundidos. La actividad antitumoral de cAC1 se mejoró mediante la generación de ADC completamente cargados en los que los ocho tioles intercatenarios estaban enlazados a derivados del agente citotóxico auristatina E como el componente de fármaco. Estos ADC fueron muy eficaces en modelos de xenoinjerto murinos a dosis bien toleradas.

Francisco et al., 23. "Blood", 12(4), 1458-1465 describen un conjugado que comprende el anticuerpo monoclonal contra CD3 quimérico cAC1 acoplado covalentemente al agente citotóxico monometil-auristatina E (MMAE) a través del enlazador peptídico de valina y citrulina. Los autores informan que el conjugado tenía una actividad antitumoral significativamente superior a la de cAC1 solo, ensayada en un modelo de xenoinjerto de ratones SCID de la enfermedad de Hodgkin.

El documento EP43225 desvela un método de radiomarcaje de una proteína con un radioisótopo de tecnecio o renio, método que comprende las etapas de poner en contacto una solución de una proteína que contiene una pluralidad de grupos sulfhidrilo libres adyacentes o, en determinados casos, proteína intacta que contiene al menos un grupo disulfuro, con iones estaño, y luego con radiopertecnetato o radioperrenato, siendo la cantidad de ión estaño suficiente para reducir de manera sustancialmente completa el radiopertecnetato o radioperrenato y recuperar la proteína radiomarcada.

Schroeder et al, 1981. Vox Sang, 4, 373-382 desvelan una globulina sérica inmunológica (GSI), preparada mediante fraccionamiento con alcohol frío de Cohn de plasma humano combinado reducido con ditiotreitol (DTT) y alquilado con yodoacetamida y otros agentes de alquilación. Los autores informan que hay unos cuantos enlaces disulfuro entre cadenas pesadas lábiles en la GSI que reaccionan rápidamente en condiciones moderadas de no disociación. Se informa que el grado de escisión de los disulfuros está controlado principalmente por la proporción del DTT con respecto a la GSI hasta que se produce la reducción de aproximadamente 4-5 enlaces disulfuro. Los autores detallan estudios sobre las variables de la concentración de GSI, la proporción del DTT con respecto a la GSI, el pH y el tiempo, que conducen a una GSI modificada químicamente que tiene un número controlado y limitado de enlaces disulfuro reducidos y alquilados.

Debido a que la convención en la producción de ADC ha sido cargarlos completamente con fármaco, no se ha apreciado anteriormente que los ADC cargados parcialmente podrían tener una eficacia terapéutica similar o superior. Además, no existían métodos que pudieran tener en cuenta que otros patrones de sustitución de anticuerpos podrían producir eficacia terapéutica igual o mejor con una toxicidad igual o inferior. Estas y otras limitaciones y problemas del pasado se resuelven mediante la presente invención.

Breve sumario

En su sentido más amplio, la invención se refiere a la materia objeto según lo definido por las reivindicaciones adjuntas.

La presente divulgación describe conjugados de proteína-fármaco y métodos de fabricación de conjugados de proteína-fármaco y marcados con proteínas. También se proporcionan proteínas que tienen puntos de conjugación para recibir un fármaco o marcador. Los conjugados se pueden usar a nivel terapéutico o de diagnóstico (por ejemplo, in vitro o in vivo), o para la formación de imágenes in vivo, y para otros usos.

En general, se proporcionan proteínas modificadas, parcialmente cargadas, que tienen puntos de conjugación asignables. Las proteínas modificadas generalmente incluyen una región de unión para la interacción con una pareja de unión y al menos dos puntos de conjugación, estando cada punto de conjugación unido covalentemente a un fármaco o marcador. Por lo general, no todos los posibles puntos de conjugación que tienen una accesibilidad o capacidad de activación similares están enlazados a un fármaco o marcador. La proteína modificada puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un receptor, un ligando de receptor, una hormona, una citoquina o similares. Los puntos de conjugación pueden ser, por ejemplo, grupos amino, grupos hidroxilo próximos, grupos hidroxilo, grupos carboxilo o grupos tiol. La proteína puede ser, por ejemplo, un receptor, un ligando de receptor, una hormona, una citoquina o similares.

En realizaciones adicionales, se proporciona un método de preparación de un conjugado de una proteína que tiene uno o más enlaces disulfuro y un fármaco reactivo con tioles libres. El método generalmente incluye reducir parcialmente la proteína con un agente reductor; y conjugar el fármaco reactivo con tioles libres a la proteína parcialmente reducida. En otra realización más, se proporciona un método de preparación de un conjugado de una proteína que tiene uno o más enlaces disulfuro y un fármaco reactivo con tioles libres. El método generalmente incluye reducir totalmente la proteína con un agente reductor; reoxidar parcialmente la proteína con un agente reoxidante; y conjugar el fármaco reactivo con tioles libres al anticuerpo.

En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo parcialmente cargado. El anticuerpo incluye una región de unión al antígeno, al menos un enlace disulfuro intercatenario y al menos dos fármacos o marcadores, estando cada fármaco o marcador conjugado a un tiol intercatenario. Opcionalmente, los puntos de la conjugación del fármaco o marcador son fácilmente asignables. En un ejemplo, el anticuerpo puede tener al menos cuatro fármacos citotóxicos o citostáticos, estando cada fármaco conjugado a un tiol intercatenario. En ciertas realizaciones, el anticuerpo tiene la configuración de las especies 4A, 4B, 4C, 4D, 4E o 4F.

El anticuerpo parcialmente cargado puede ser, por ejemplo, un anticuerpo murino, humanizado, humano o quimérico. El fármaco puede ser, por ejemplo, un agente citotóxico o citostático tal como, por ejemplo, MMAF, MMAE o AFP. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos parcialmente cargados.

En otra realización, se proporcionan anticuerpos que tienen al menos un punto de conjugación para un agente citotóxico o citostático, en la que el punto de conjugación para el agente citotóxico o citostático en el anticuerpo se puede asignar fácilmente. En el anticuerpo,... [Seguir leyendo]

1. Un método de conjugación de un fármaco a un anticuerpo que da lugar a selectividad en la colocación del fármaco, que comprende:

reducir totalmente el anticuerpo con un agente reductor;

tratar el anticuerpo totalmente reducido con cantidades limitantes de un agente reoxidante para volver a formar al menos un enlace disulfuro intercatenario del anticuerpo, de modo que queden al menos dos tioles intercatenarios; y

conjugar el fármaco a los tioles intercatenarios.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el agente reoxidante es ácido 5,5'-ditio-bis-2-nitrobenzoico, 4,4'- ditiodipiridina, 2,2'-ditiodipiridina, tetrationato de sodio o ácido yodosobenzoico.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el fármaco es un agente citostático o citotóxico, o un agente inmunosupresor.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el agente citostático o citotóxico es un enlazadordel surco menor, un éster producido por la reacción de auristatina E con ácido paraacetilbenzoico (AEB), un éster producido mediante la reacción de auristatina E con ácido benzoilvalérico (AEVB),

(MMAF),

(MMAE)o

(AFP).

5. El método de la reivindicación 1, en el que el agente reductor es DTT o TCEP.

6. El método de la reivindicación 1, que comprende además purificar el anticuerpo parcialmente reoxidado.

7. Un método de producción de un anticuerpo con conjugación selectiva de fármaco, que comprende:

reducir totalmente el anticuerpo durante un período de tiempo suficiente para producir tioles intercatenarios, según lo determinado por titulación con DTNB, mediante la adición de un gran exceso de un agente reductor y la incubación de la solución a aproximadamente 37 2C durante aproximadamente 3 minutos; purificar el anticuerpo;

volver a oxidar parcialmente el anticuerpo usando un agente oxidante para formar al menos un enlace disulfuro

intercatenario mediante el enfriamiento del anticuerpo reducido hasta 2C;

tratar el anticuerpo reducido y enfriado con de 1,5 a 2,5 equivalentes molares del agente oxidante;

mezclar la solución por inversión;

dejar que la solución se incube a aproximadamente 2C durante aproximadamente 1 minutos; purificar el anticuerpo parcialmente reoxidado;

conjugar el fármaco a los tioles intercatenarios del anticuerpo parcialmente reoxidado para formar un anticuerpo conjugado; y

purificar el anticuerpo conjugado.

8. El método de la reivindicación 1, en el que el fármaco es MMAE y está conjugado al anticuerpo parcialmente reoxidado a través de un enlazadorde maleimidocaproil-valina-citrulina.

9. Un método de preparación de una mezcla de conjugados de anticuerpo y fármaco, que comprende:

reducir totalmente anticuerpos con un agente reductor para formar anticuerpos totalmente reducidos; volver a oxidar parcialmente los anticuerpos totalmente reducidos con un agente reoxidante para volver a formar al menos un enlace disulfuro intercatenario de los anticuerpos, formando así anticuerpos parcialmente reoxidados; y

conjugar un fármaco a un tiol intercatenario de los anticuerpos parcialmente reoxidados para formar conjugados de anticuerpo y fármaco.

1. El método de la reivindicación 9, en el que el fármaco es un agente citotóxico o citostático.

11. El método de la reivindicación 1, en el que el agente citotóxico o citostático es un enlazador del surco menor, AEB, AEVB, MMAF, MMAE o AFP.

12. El método de la reivindicación 9, en el que al menos dos fármacos están conjugados al anticuerpo conjugado y cada fármaco está conjugado a un tiol intercatenario.

13. El método de la reivindicación 9, en el que el número medio de fármacos por anticuerpo de la mezcla de conjugados de anticuerpo y fármaco es de dos.

14. El método de la reivindicación 9, en el que el número medio de fármacos por anticuerpo de la mezcla de conjugados de anticuerpo y fármaco es de cuatro.

15. El método de la reivindicación 9, en el que el fármaco es MMAE y está conjugado al anticuerpo parcialmente reoxidado a través de un enlazadorde maleimidocaproil-valina-citrulina