Anticuerpo penta-específico.

Un anticuerpo penta-específico que tiene especificidad por y neutraliza cada una de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/060424.

Solicitante: GLAXOSMITHKLINE LLC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: Corporation Service Company, 2711 Centreville Road, Suite 400 Wilmington, Delaware 19808 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: GERMASCHEWSKI,VOLKER, JONAK,ZDENKA,LUDMILA, CLEGG,STEPHANIE JANE, DOBRZYNSKI,ERIC, ELLIS,JONATHAN H, GODILLOT,ALEXIS PAUL, LEWIS,ALAN P, WHITE,JOHN R.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K39/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
  • C07K16/18 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales animales o humanos.
  • C07K16/24 C07K 16/00 […] › contra citoquinas, linfoquinas o interferones.

PDF original: ES-2547475_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Anticuerpo penta-específico Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene múltiples especificidades. En particular, el anticuerpo de la presente invención se une a y neutraliza cada una de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78. El anticuerpo puede ser útil en métodos para tratar enfermedades o trastornos caracterizados por un nivel elevado o desequilibrado de una o más de las siguientes proteínas: IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78, particularmente COPD, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis erosiva, asma, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis, rechazo de trasplantes, gota, cáncer, lesión pulmonar aguda, enfermedad pulmonar aguda, sepsis, ARDS, enfermedad arterial periférica, esclerosis sistémica, síndrome de insuficiencia respiratoria en recién nacidos, exacerbación del asma y COPD, fibrosis quística, panbronquiolitis difusa, lesión de reperfusión y/o endometriosis con dicho anticuerpo.

Antecedentes de la invención

Los datos e informes publicados indican que los miembros de la subfamilia ELRCXC de quimioquinas CXCL presentan niveles elevados en varias enfermedades. Hay un total de 16 miembros de la familia CXCL. Se ha informado que las quimioquinas están reguladas positivamente en vahas enfermedades inflamatorias, incluyendo COPD, donde están elevados los niveles de CXCL1-3, 5 y 8, también conocidas como Gro-a, -(5, -y (Haskill, S., et al. Proc. Nati. Acad. Sci., 1990: 87, 7732-7736), ENA-78 (Wang, D. y Richmond, A., Cytokine Reference. Oppenheim, J.J. y Feldman, M. ed., Academic Press, Londres, 1023-1027, Powerm C.A. et al. Gene., 1994: 151, 333-334) e IL-8 (lizasa, H. y Matsushima, K., Cytokine Reference. Oppenheim, J.J. y Feldman, M. ed., Academic Press, Londres, 1061-1067, Matsushima, K. et al., J. Exp. Med. 1988: 167, 1883-1893) respectivamente (Am. J. Respir. Crit Care Med., 163: 349-355, 2001, Am. J. Respir. Crit Care Med., 168: 968-975, 2003, Thorax, 57: 590-595, 2002). Se ha postulado que la expresión prolongada y elevada de estas quimioquinas podría estar implicada en el desarrollo de enfermedades tales como COPD, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis erosiva, asma, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis, rechazo de trasplantes, gota, cáncer, lesión pulmonar aguda, enfermedad pulmonar aguda, sepsis, ARDS, enfermedad arterial periférica, esclerosis sistémica, síndrome de insuficiencia respiratoria en recién nacidos, exacerbación del asma y COPD, fibrosis quística, panbronquiolitis difusa, lesión de reperfusión o endometriosis. Se sabe que estas quimioquinas CXC estimulan la quimiotaxis de neutrófilos acoplándose a y activando los receptores CXCR1 y/o CXCR2. Por lo tanto, la inhibición de estas quimioquinas puede prevenir que las células inflamatorias se infiltren en el tejido pulmonar, previniendo de esta manera la lesión del tejido. La presente invención se refiere a la inhibición de la activación de los receptores CXCR1 y CXCR2 usando un anticuerpo que tiene la capacidad de unirse a IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78, es decir, un anticuerpo penta-específico.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo (¡nmunoglobulina) que tiene múltiples especificidades contenidas dentro de una ¡nmunoglobulina. En particular, el anticuerpo de la presente invención se une a y neutraliza cada una de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78. El anticuerpo de la presente invención puede ser útil para tratar enfermedades o trastornos caracterizados por un nivel elevado o desequilibrado de una o más de las siguientes proteínas: IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78, particularmente COPD, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis erosiva, asma, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis, rechazo de trasplantes, gota, cáncer, lesión pulmonar aguda, enfermedad pulmonar aguda, sepsis, ARDS, enfermedad arterial periférica, esclerosis sistémica, síndrome de insuficiencia respiratoria en recién nacidos, exacerbación del asma y COPD, fibrosis quística, panbronquiolitis difusa, lesión de reperfusión y/o endometriosis con dicho anticuerpo.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado que tiene especificidad por y neutraliza cada una de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78; de esta manera, el anticuerpo de la presente invención se define como un anticuerpo penta-específico (o pan-ELR). La definición del anticuerpo incluye una porción (o fragmento) de unión a antígenos del anticuerpo tal que la porción (o fragmento) de unión a antígenos se une a IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78. Preferiblemente, el anticuerpo penta-específico de la invención es un anticuerpo monoclonal murino, quimérico, humano o humanizado. Para evitar cualquier duda, no es necesario que el anticuerpo penta-específico de la presente invención se una únicamente a antígenos IL-8, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78 humanos, sino que también puede unirse a otras proteínas relacionadas (tales como GCP-2 humana, o incluso puede unirse a ortólogos no humanos de IL-8, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma, ENA-78 y GCP-2); en otras palabras, el anticuerpo penta-específico de la presente invención se une mínimamente a IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78.

Preferiblemente, un anticuerpo penta-específico de la presente invención se une a cada una de las IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78 con valores de constante de equilibrio, KD, de menos de 10"7 M, más preferiblemente menos de 10"8 M y aún más preferiblemente menos de 10'9 M, determinados por resonancia de plasmón superficial. Típicamente, la medición de resonancia de plasmón superficial se realiza como se describe a

continuación.

En una realización, el anticuerpo penta-específico se une dentro de un epítopo de KELRCQCIKTYSKP (SEQ ID N°: 54) de la IL-8 humana.

En una realización, el anticuerpo penta-específico de la presente invención se genera mediante un método que comprende las etapas de usar un protocolo de tipo RIMM (Kilpatrick, K.E., et al. Hybridoma. 1997: 16, 381) usando una mezcla (cóctel) de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78 junto con una serie de cinco péptidos antigénicos múltiples (MAP), teniendo cada unidad de MAP una secuencia separada de los polipéptidos de los números de identificación: 49-53.

LATELRSQSLQTLQG

SEQ ID N°: 49

SAKELRSQSIKTYSK

SEQ ID N°: 50

LRELRSVSLQTTQG

SEQ ID N°: 51

SPGPHSAQTEVIAT

SEQ ID N°: 52

ESGPHSANTEIIVK

SEQ ID N°: 53

Sin limitarse por la teoría, los MAP tienen dos funciones dentro del protocolo de inmunización. En primer lugar, los MAP permiten una presentación múltiple selectiva de una secuencia de aminoácidos diana conocida al sistema inmune del hospedador. En segundo lugar, el aumento de masa, debido a múltiples copias de la secuencia unida mediante un núcleo, tal como, pero sin limitación, a lisina, aumenta la inmunogenicidad de la secuencia por encima de la de péptidos individuales (Francis, J.P., et al., Immunology, 1991: 73; 249, Schott, M.E., et al., Cell. Immuno. 1996: 174: 199-209, Tam, J.P. Proc. Nati. Acad. Sci. 1988: 85; 5409-5413).

Los MAP usados para generar esta invención comprenden múltiples copias de las secuencias diana conservadas (por ejemplo, SEQ ID N°: 49-53) encontradas con y alrededor de las regiones ELRCXC y GPHCA de quimioquinas diana. En la Figura 1 se representa una serie de MAP ilustrativos.

En una realización, se genera un anticuerpo penta-específico de la presente invención mediante un método que comprende las etapas de:

a. inyectar en un ratón una mezcla de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78 en adyuvante completo de Freund (cFA);

b. inyectar en el ratón una mezcla de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78 en adyuvante incompleto de Freund (¡FA); y

c. Inyectar en el ratón una mezcla de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78, y una serie de cinco péptidos antigénicos múltiples (MAP), teniendo cada unidad de MAP una secuencia distinta de los polipéptidos con los números de Identificación: 49-53 en adyuvante incompleto de Freund;

d. aislar células B del ratón;

e. fusionar las células B con células de mleloma para formar células de hibridoma inmortales que secreten el anticuerpo penta-específico deseado; y

f. aislar el anticuerpo penta-específico... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un anticuerpo penta-específico que tiene especificidad por y neutraliza cada una de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro- beta, Gro-gamma y ENA-78.

2. Un anticuerpo según la reivindicación 1, que se une a IL-8 humana Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78 con una constante de equilibrio KD con valores menores de 10'7 M, 10 ® M o 10'9 M determinados por resonancia de plasmón superficial.

3. Un método para producir un anticuerpo penta-específico que comprende las etapas de:

a. inyectar en un ratón una mezcla de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78 en adyuvantes de Freund (cFA);

b. inyectar en el ratón una mezcla de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78 en adyuvante incompleto de Freund (¡FA); y

c. inyectar en el ratón una mezcla de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78, y una serie de 5 péptidos antigénicos múltiples (MAP) teniendo cada unidad de MAP una secuencia distinta de los polipéptidos de la SEQ ID N°: 49-53 en adyuvante incompleto de Freund;

d. aislar células B a partir del ratón;

e. fusionar las células B con células de mieloma para formar células de hibridoma inmortales que secreten el anticuerpo penta-específico deseado; y

f. aislar el anticuerpo penta-específico del sobrenadante del cultivo del hibridoma.

4. Un método para obtener un anticuerpo penta-específico que comprende las etapas de:

a. inyectar en un ratón una serie de 5 péptidos antigénicos múltiples (MAP), teniendo cada unidad de MAP una secuencia distinta de los polipéptidos de ID N°: 49-53 (la serie de MAP) en adyuvante completo de Freund.;

b. inyectar en el ratón la serie de MAP en adyuvante incompleto de Freund;

c. inyectar en el ratón una mezcla de IL-8 humana, Gro-alfa, Gro-beta, Gro-gamma y ENA-78 y la serie de MPA en adyuvante incompleto de Freund (¡FA);

d. aislar células B a partir del ratón; y

e. fusionar las células B con células de mieloma para formar células de hibridoma inmortales que secreten el anticuerpo penta-específico deseado; y

f. aislar el anticuerpo penta-específico del sobrenadante del cultivo del hibridoma.

5. Un anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende:

a. regiones variables de cadena pesada y ligera codificadas por secuencias de nucleótidos que comprenden las secuencias de la SEQ ID N°:1 y la SEQ ID N°: 3, respectivamente;

b. regiones variables de cadena pesada y ligera codificadas por secuencias de nucleótidos que comprenden secuencias de la SEQ ID N°:5 y la SEQ ID N°: 7, respectivamente;

c. una región variable de cadena pesada codificada por secuencias de nucleótidos que comprenden la secuencia de la SEQ ID N°:9;

d. secuencias que comprenden secuencias de la SEQ ID N°: 11, y de la SEQ ID N°:47, 59, 61 ó 63, respectivamente; o

e. cadenas ligeras y pesadas codificadas por secuencias nucleotídicas que comprenden secuencias que comprenden secuencias con una identidad de al menos 90%, 95%, 98% ó 99% con secuencias de la SEQ ID N°: 11, y de la SEQ ID N°: 47, 59, 61 ó 63, respectivamente.

6. Un anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende

a. regiones variables de las cadenas pesada y ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2 y la SEQ ID N°: 4, respectivamente;

b. regiones variables de las cadenas pesada y ligera que comprenden polipéptidos que tienen una identidad

de al menos 90%, 95%, 98% ó 99% con las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2 y la SEQ ID N°: 4, respectivamente;

c. regiones variables de las cadenas pesada y ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID N°: 6, y la SEQ ID N°: 8, respectivamente;

d. regiones variables de las cadenas pesada y ligera que comprenden polipéptidos que tienen una identidad de al menos 90%, 95%, 98% ó 99% con las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID N°: 6 y la SEQ ID N°:84, respectivamente;

e. una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 10, o una secuencia de aminoácidos que tiene una Identidad de al menos 90%, 95%, 98% ó 99% con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 10;

f. cadenas pesada y ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID N°:46, y las SEQ ID N°: 48, 60, 62 o 64, respectivamente; o

g. cadenas pesada y ligera que comprenden polipéptidos que tienen una identidad de al menos 90%, 95%, 98% ó 99% con las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID N°: 46 y las SEQ ID N°: 48, 60, 62, o 64, respectivamente.

7. Un anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende al menos una región variable seleccionada de (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, o 10; o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90%, 95%, 98% ó 99% con una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de (i) anteriores.

8. Un anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende:

a. al menos una secuencia de CDR seleccionada de SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 y 18;

b. al menos una secuencia de CDR seleccionada de SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23 y 24; o

c. al menos una secuencia de CDR seleccionada de SEQ ID NOs: 25, 26 y 27.

9. Un anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende una secuencia polinucleotídica que codifica :

a. el polipéptido de SEQ ID NO:15;

b. el polipéptido de SEQ ID NO:21; o

c. polipéptido de SEQ ID NO:27.

10. Un anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende:

a. al menos 4 secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, y 18; o

b. al menos 4 secuencias de CDR seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, y 24.

11. Un anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende:

a. Secuencias de CDR de SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 y 18;

b. regiones variables de cadenas ligera y pesada que comprenden las secuencias de CDR de SEQ ID NOs: 13, 14, y 15 y SEQ ID NOs: 16, 17, y 18, respectivamente;

c. secuencias de CDR de SEQ ID NOs: 19, 20, 21,22, 23, y 24;

d. regiones variables de cadenas ligera y pesada que comprenden las secuencias de CDR de SEQ ID NOs: 19,20, y 21, y SEQ ID NOs: 22, 23, y 24, respectivamente;

e. Secuencias de CDR de SEQ ID NOs: 25, 26, y 27; o

f. una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR de SEQ ID NOs: 25, 26, y 27.

12. Un anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende las secuencias de CDR de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 y 18.

13. Un hibridoma o transfectoma que produce un anticuerpo penta-específico que comprende secuencias de CDR de:

a. SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, y 18;

b. SEQ ID NOs: 19,20,21,22,23, y 24; o

c. SEQ ID NOs: 25, 26, y 27.

14. Una célula eucariótica o procariótica que produce un anticuerpo que comprende:

a. secuencias de CDR de SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, y 18;

b. secuencias de CDR de SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23, y 24;

c. secuencias de CDR de SEQ ID NOs: 25, 26, y 27;

d. una cadena ligera y/o pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, o SEQ ID NO:48, 60, 62, o 64 , respectivamente; o

e. una cadena ligera y/o pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90%, 95%, 98% ó 99 con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° 46 o de las SEQ ID N°: 48, 60, 62 ó 64, respectivamente.

15. Un anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de, respectivamente:

(a) SEQ ID NO:46 and SEQ ID NO:48;

(b) SEQ ID NO:46 and SEQ ID NO: 62;

(c) SEQ ID NO:46 and SEQ ID NO: 60; o

(d) SEQ ID NO:46 and SEQ ID NO: 64.

16. Un anticuerpo según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo se une dentro del epitopo de KELRCQCIKTYSKP (SEQ ID NO: 54) de IL-8 humana.

17. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo penta-específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5 a 12, o 14 a 16 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Un anticuerpo penta-específico según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5 a 12, 15 y 16 para uso en el tratamiento o la prevención de EPOC, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis erosiva, asma, aterosclerosis, enfermedad intestinal inflamatoria, psoriasis, rechazo de trasplantes, gota, cáncer, lesión pulmonar aguda, enfermedad pulmonar aguda, sepsis, ARDS, enfermedad de las arterias periféricas, esclerosis sistémica, síndrome de dificultad respiratoria en neonatos, exacerbación de asma y EPOC, fibrosis quística, panbronquiolitis difusa, lesión por repercusión, y/o endometriosis.

19. Un proceso para producir un anticuerpo penta-específico (inmunoglobulina) en una sola célula hospedadora, que

comprende las etapas de:

(i) transformar dicha célula hospedadora individual con

(a) una primera secuencia de ADN que codifica al menos el dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende dominios de CDR de las SEQ ID N°: 13, 14 y 15; y una segunda secuencia de ADN que codifica al menos el dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende dominios CDR de SEQ ID N°: 16, 17 y 18;

(b) una primera secuencia de ADN que codifica al menos el dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende dominios de CDR de las SEQ ID N°: 19, 20 y 21; y una segunda secuencia de ADN que codifica al menos el dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina que comprende dominios CDR de SEQ ID N°: 22, 23 y 24; o

(c) una primera secuencia de ADN que codifica una cadena pesada que comprende polipéptido de SEQ ID N° 46; y una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera que comprende un polipéptido de SEQ ID N°: 48, 60, 62, o 64; y

(ii) expresar dicha primera secuencia de ADN y dicha segunda secuencia de ADN de forma que se produzcan dichas cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina como moléculas separadas en dicha célula hospedadora individual transformada.


 

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