ADN triciclo-fosforotioato.

Una molécula de ácido nucleico que comprende triciclo-nucleósidos unidos por enlaces fosforotioato internucleosídicos (enlaces 3'-OPS-O-5').

ADN triciclo-fosforotioato Campo de la invención La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de triciclonucleósidos unidos por enlaces fosforotioato internucleosídicos. La invención también se refiere a oligonucleótidos antisentido sintéticos y a métodos en los que se emplean.

Antecedentes de la invención Los triciclo-ADN (tc-ADN) son una clase de análogos de ADN restringidos en los que cada nucleótido está modificado por la introducción de un anillo de ciclopropano para restringir la flexibilidad conformacional de la cadena principal y optimizar la geometría del ángulo de torsión γ de la cadena principal. Los tc-ADN que contienen adenina y timina homobásicos forman pares de bases A-T extraordinariamente estables con los ARN complementarios.

Recientemente, los autores de la presente invención han propuesto el uso de las propiedades ventajosas de esta clase de ácidos nucleicos en oligonucleótidos antisentido para el tratamiento diversas enfermedades. La Solicitud Internacional Núm. PCT/EP2010/054735 describe oligonucleótidos antisentido sintéticos y métodos que emplean oligonucleótidos antisentido para modificar eventos de corte y empalme que se producen durante el procesamiento del pre-ARNm o para regular a la baja la expresión de ARNm mutado que contiene secuencias repetidas, tales como, por ejemplo, CUG, CAG, y/o CCUG 3' o 5'. Más específicamente, se ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido de triciclo-ADN son eficaces para facilitar la omisión de exones durante el procesamiento del pre-ARNm, para enmascarar secuencias intrónicas silenciadoras y/o secuencias tallo-bucle en el pre-ARNm, y en el direccionamiento de la destrucción del ARNm mediada por ARNasa.

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es la miopatía hereditaria más común, que afecta aproximadamente a uno de cada 3500 varones, independientemente de la etnia. La consecuencia más importante de la DMD es que las fibras musculares se vuelven particularmente frágiles y la actividad muscular natural provoca daños generales en el tejido muscular. La carencia de distrofina hace que las fibras musculares sean particularmente vulnerables al estrés mecánico, y experimenten ciclos de necrosis recurrentes. Como resultado, los pacientes muestran una debilidad progresiva de los músculos esqueléticos, que con el tiempo son reemplazado por tejido adipofibrótico, lo que conduce a la pérdida de deambulación a la edad de doce años, con lo cual la muerte prematura es causada por insuficiencia respiratoria o cardiomiopatía. Además, aproximadamente un tercio de los pacientes con DMD también muestran deterioro cognitivo lo que sugiere una alteración notable de la función neuronal y cerebral. La DMD afecta a todos los músculos voluntarios e implica al corazón y a los músculos respiratorios en las fases más tardías de la enfermedad. El corazón y el SNC deberían por lo tanto preferiblemente ser el objetivo de cualquier terapia implementada para tratar o aliviar los síntomas de los pacientes con DMD.

Se buscó un nueva clase de compuestos que tuvieran una eficacia mejorada en comparación con los oligonucleótidos de triciclo-ADN. La presente invención describe la síntesis, propiedades y usos de los triciclonucleótidos fosforotioato.

Compendio de la invención Los autores de la presente invención han demostrado sorprendentemente que las moléculas de ácido nucleico que comprende los triciclo-nucleótidos fosforotioato son, además de su capacidad compartida con las moléculas de tc-ADN de ser activos en una amplia gama de músculos, altamente eficaces para penetrar en el tejido cardíaco y son altamente activos en células cardíacas. También se ha demostrado que tales triciclo-nucleótidos fosforotioato son capaces de rescatar la expresión de una proteína, en particular, la distrofina, en el SNC después de la administración sistémica.

La invención se refiere por lo tanto a moléculas de ácido nucleico que comprenden triciclo-nucleósidos unidos por enlaces fosforotioato internucleosídicos (enlaces 3'-OPS-O-5') . Las moléculas de ácido nucleico de la invención también son referidas como " triciclo-ADN fosforotioato " o "tc-ADN-PS" en la presente descripción.

La invención también se refiere a una composición que comprende un tc-ADN-PS y un portador. La composición puede ser en particular una composición farmacéutica, en donde el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. La composición de la invención también puede comprender opcionalmente un agente activo adicional.

La presente invención también se refiere a un método para sintetizar moléculas de tc-ADN-PS.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención son particularmente útiles como oligonucleótidos antisentido (AON) , en particular para la obtención de un efecto antisentido en los músculos y en las células cardiacas, o en el SNC, en particular, después de la liberación sistémica del AON. La presente invención por lo tanto también proporciona AON de tc-ADN-PS

Puesto que los autores de la presente invención han demostrado que después de la administración sistémica, un AON de tc-ADN-PS de acuerdo con la invención puede corregir la expresión de la distrofina en los músculos, en el tejido cardíaco y en el SNC, la invención se refiere adicionalmente a métodos que emplean los AON de tc-ADN-PS para el tratamiento de enfermedades. Las enfermedades representativas incluyen, por ejemplo, enfermedades del corazón, tales como la cardiomiopatía hipertrófica obstructiva causada por mutaciones cMYBP-C y enfermedades neuromusculares tales como la distrofia muscular de Duchenne, la atrofia muscular espinal, y la distrofia miotónica de Steinert. Más generalmente, la invención se refiere a un método de corrección de la expresión génica anormal en una célula de un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto un oligonucleótido antisentido de tc-ADN-PS, en donde dicho oligonucleótido antisentido de tc-ADN-PS es complementaria a una porción de un ARN codificado por dicho gen. En una realización preferida, dicho oligonucleótido antisentido de tc-ADN-PS se administra periféricamente al sujeto en una cantidad suficiente para corregir dicha expresión anormal. La administración periférica preferida incluye la inyección sistémica tal como la inyección intravenosa, intraperitoneal o intra-arterial.

La invención también se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad genética causada por la expresión génica anormal en un tejido o una célula de un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto un oligonucleótido antisentido de tc-ADN-PS, en donde dicho oligonucleótido antisentido de tc-ADN-PS es complementario a una porción de un ARN codificado por dicho gen. El oligonucleótido antisentido de tc-ADN-PS se administra de manera preferente periféricamente al sujeto en una cantidad suficiente para corregir dicha expresión anormal. En particular, el tejido o la célula se pueden seleccionar entre tejidos o células musculares, cardiacos y del SNC.

Se ha demostrado que los tc-ADN-PS de la presente invención son transportados en el torrente sanguíneo después de la aplicación subcutánea o sistémica intravenosa/intraperitoneal a todos los músculos esqueléticos, al SNC y al músculo cardiaco y absorbidos por estos tejidos.

Otros objetos y aplicaciones se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.

Descripción de los dibujos La Figura 1 muestra las estructuras químicas y las secuencias de oligonucleótidos de PMO morfolino, 2'O-Me-PS-ARN, tc-ADN y Tc-ADN fosforotioato utilizadas para la omisión del exón 23 del pre-ARNm de distrofina en ratón mdx.

La Figura 2 es un gel de agarosa de reacciones de PCR anidadas que muestran la omisión del pre-ARNm de la distrofina en diferentes músculos de ratones mdx de 8 semanas de edad a los que se ha inyectado alternativamente a través de las rutas intravenosa y subcutánea 100 mg/kg de tc-oligonucleótido PS (+2-13) . También se representa un diagrama que muestra los diferentes exones presentes en el pre-ARNm de la distrofina (con o sin la omisión del exón 23) y la posición de los cebadores utilizados para la PCR anidada.

Leyenda: Detección del ARNm de distrofina con omisión del exón 23 en músculos mdx después del tratamiento sistémico con el oligómero tc-ADN-PS M23D (+2-13) . Los ratones mdx fueron tratados dos veces por semana con inyecciones subcutáneas e intravenosas de M23D (+2-13) durante 8 semanas, con una dosis de 100 mg/kg de peso corporal. Una semana después de la última inyección, los músculos se recogieron y las muestras de ARN se analizaron mediante RT-PCR anidada con cebadores... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende triciclo-nucleósidos unidos por enlaces fosforotioato internucleosídicos (enlace.

3. OPS-O-5') .

2. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende entre 3 y 50 5 nucleótidos.

3. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que es complementaria a una secuencia diana.

4. la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, siendo la molécula de ácido nucleico un oligonucleótido antisentido complementario a una porción de un ARN codificado por un gen.

5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende o consiste en la secuenci.

5. AACCTCGGCTTACCT-3' (SEQ ID NO: 1) .

6. Un método para sintetizar una molécula de triciclo-ADN fosforotioato, comprendiendo el método:

a) proporcionar un primer triciclo-nucleósido unido a un soporte en fase sólida, teniendo dicho primer nucleótido un grup.

5. OH protegido;

b) desproteger el grupo 5' para formar un grup.

5. OH libre;

c) hacer reaccionar el grup.

5. OH libre con un monómero de triciclonucleosido-3'-O-cianoetil-N, Ndiisopropilaminofosforamidita protegido en 5' para formar un enlace fosforamidita internucleosídico entre el primer y una segundo triciclo-nucleósidos; y d) sulfurar el grupo fosforamidita internucleosídico para formar un enlace internucleosídico fosforotioato entre el 20 primer y segundo triciclo-nucleósidos.

7. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en un portador farmacéuticamente aceptable.

8. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso como medicamento.

9. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en el tratamiento de una enfermedad del corazón.

10. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento de una enfermedad neuromuscular o musculoesquelética.

11. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en 30 el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso central.

12. La molécula de ácido nucleico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde la enfermedad del corazón, del SNC, neuromuscular o musculoesquelética resulta de una alteración de un gen, en donde dicha alteración es una mutación en marco de un exón, una mutación que interrumpe el marco de lectura traduccional del gen, y el tc-ADN facilita la omisión de un exón con el fin de restablecer el marco de lectura;

una mutación deletérea que puede ser compensada mediante la inclusión de un exón atípico en el ARNm codificado por dicho gen, y el tc-ADN es complementario a una ISS o un TSL presentes en un pre-ARNm codificado por dicho gen y facilita la inclusión de un exón atípico, o una mutación que da como resultado la presencia de una o varias amplificaciones CUG 3' deletéreas en un ARNm codificado por dicho gen.

13. La molécula de ácido nucleico para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, para el tratamiento de la Distrofia Muscular de Duchenne, la Atrofia Muscular Espinal, o la Distrofia Miotónica de Steinert.