Vectores de closterovirus y métodos.

Un vector de transferencia génica de plantas para silenciamiento génico inducido por virus,

comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifica:

a) genes virales de virus asociado con el enrollamiento de la vid 2 (LR-2) que comprenden metiltransferasa, ARN helicasa y ARN polimerasa dependiente de ARN;

b) un supresor de ARNi;

c) proteasas líder L1 y/o L2; y

d) un polinucleótido heterólogo unido operativamente a un promotor, en el que el polinucleótido heterólogo se expresa en una célula vegetal,

en donde el vector de transferencia génica de plantas es competente para replicación y capaz de replicar de forma infecciosa en la célula vegetal, y el ácido nucleico codifica las proteasas líder L1 y L2, o

en donde el vector de transferencia génica de plantas replica de forma condicionada y en donde al menos una proteasa líder seleccionada de L1 y L2 está inactivada de modo que el vector no pueda replicarse de forma infecciosa independientemente.

Vectores de closterovirus y métodos Referencia cruzada a solicitudes relacionadas La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 61/063.305, presentada el 31 de enero de 2008 y Nº 61/083.504, presentada el 24 de Julio de 2008.

Campo La presente divulgación se refiere al campo de los closterovirus y su uso como vehículos de suministro génico para plantas.

Antecedentes Las vides (Vitis) son un cultivo frutal global importante con enorme importancia económica y cultural, particularmente Vitis vinifera, que se usa para el cultivo del vino. Se usan comercialmente un número relativamente pequeño de cultivares de V. vinifera para mantener la uniformidad en el fruto dado que las plantas son heterocigotas y no de pura cepa. Por lo tanto, debido a que gran parte del cultivo de uva comercial depende de estos cultivares, que tienen diversidad limitada; la resistencia a enfermedad es una preocupación importante. Las técnicas de cultivo clásicas para aumentar la resistencia a enfermedad generalmente merman la igualdad del fruto, haciendo a las vides un candidato perfecto para la manipulación genética para mejorar la resistencia a enfermedad. Sin embargo, la producción de vides transgénicas ha resultado ser difícil, ya que se sabe que las especies perennes leñosas, tales como las vides, son resistentes a transformación, y el proceso de selección requerido por transformación mediada por Agrobacterium es significativamente más riguroso debido a la competición por las células no transformadas, lo que conduce a tasas de éxito altamente variables (Mullins et al., Meth. Mol. Bio. 344: 273-285. 1990) ; Bouquet et al., Methods Mol. Biol. 344: 273-285, 2006) . Por lo tanto, existe la necesidad de un método fiable, eficaz, para el suministro de genes a vides para tratamientos de enfermedades y la modificación de vides para características deseadas.

Durante las últimas dos décadas, los vectores virales para la expresión de resistencia de las proteínas en plantas y animales se han convertido en herramientas indispensables de la biología molecular y la biomedicina (Pogue et al., Annu. Rev. Phytopathol. 40: 45-74, 2002; Gleba et al., Curr Opin Biotechnol 18: 134-141, 1007) . Con la aparición de la interferencia de ARN (ARNi) o silenciamiento de ARN, también se han desarrollado vectores virales para silenciamiento de genes inducido por virus o VIGS (Godge et al., Plant Cell Rep 27 (2) : 209-219, 2008; e-pub antes de la impresión, 2007) . Tomadas juntas, una capacidad para sobreexpresar rápidamente o silenciar genes de interés ha hecho a los vectores virales herramientas importantes en la genómica funcional.

Se han introducido por ingeniería genética varios virus vegetales en vectores virales, cada uno con limitaciones y especificidad vegetal. La mayoría son adecuados solamente para su uso en plantas herbáceas dicotiledóneas. En su mayoría, los virus icosaédricos no están bien adaptados para acomodar genes ajenos principalmente debido al tamaño limitado de sus cápsidas. En general, los virus elongados han mostrado una mejor capacidad para tolerar genes recombinantes y expresarlos hasta niveles muy altos. En la actualidad, los vectores más habitualmente usados son los basados en el virus del mosaico del tabaco en forma de bastón (TMV, género Tobamovirus) (Pogue et al., Annu. Rev. Phytopathol. 40: 45-74, 2002; Gleba et al., Curr Opin Biotechnol 18: 134-141, 1007) . Estos vectores se caracterizan por altos niveles de expresión pero estabilidad genética relativamente baja, especialmente en lo que se refiere a insertos ajenos grandes.

Otra serie de vectores se basa en el virus del rayado del tabaco con forma de bastón (TRV, género Tobravirus) (Godge et al., Plant Cell Rep 27 (2) : 209-219, 2008; e-pub antes de la impresión, 2007) . Los vectores derivados de virus filamentosos se basan habitualmente en el virus X de la patata (PVX, género Potexvirus) (Chapman et al., Plant J 2: 549-557, 1992) y virus del marcado del tabaco (TEV, género Potyvirus) (Dolja et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10208-10212, 1992) . Los vectores de TMV, TRV y PVX contienen un casete de expresión con un promotor de ARN subgenómico, mientras que los vectores de TEV usan un principio alternativo de expresión proteica basado en procesamiento de poliproteínas. Esta última característica proporciona a los vectores potyvirales una estabilidad genética mucho mayor que la hallada en vectores que contienen promotores (Dolja et al., Virology 252: 269-274, 1998) .

Se han desarrollado vectores de expresión génica basados en el virus del amarilleo de la remolacha (BYV, género Closterovirus) (Hagiwara et al., J. Virol. 73: 7988-7993, 1999; Peremyslov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96, 14771-14776, 1999) . Aunque los niveles de expresión proteica que pueden conseguirse para vectores closterovirales pueden ser menores que los de TMV o TRV, se ha demostrado que estos vectores son muy estables genéticamente y capaces de acomodar varios casetes de expresión basándose en promotores de ARN subgenómico heterólogos adicionales o procesamiento de poliproteínas. Dicha versatilidad de vectores closterovirales se debe más probablemente al gran tamaño de genomas closterovirales y presencia de genes que

aumenta drásticamente la replicación genómica y capacidad de expresión génica y posiblemente proporcionan una mayor fidelidad de copia de ARN (Dolja et al., Virus Res. 117: 38-51, 2006) . Los supresores fuertes de ARNi (Reed et al., Virology 306: 203-209, 2003; Chiba et al., Virology 346: 7-14, 2006) y proteinasas líder de closterovirus (Peng et al., J. Virol. 75 (24) , 12153-12160, 2001) están entre los genes que aseguran alto rendimiento genético y evolutivo de closterovirus y precondicionan sus genomas para acomodar genes adicionales, virales o ajenos.

Una de las características más críticas del vector viral es su serie de hospedadores que limita gravemente su utilidad potencial para las plantas de cultivo deseadas. Todos los vectores descritos anteriormente son capaces de infectar solamente plantas herbáceas dicotiledóneas. En otras palabras, la necesidad de generar un vector viral para monocotiledóneas o para cultivos leñosos tales como la vid dicta la necesidad de usar virus que infectan de forma natural a dichas plantas como una plataforma para el desarrollo de vectores.

Hasta la fecha, se han desarrollado muy pocos vectores virales potencialmente adecuados para plantas leñosas, y los datos muestran que la expresión se ha limitado normalmente a una serie estrecha de plantas modelo. Uno de estos vectores se basa en el ARN 2 de virus esférico latente de manzana (ALSV, familia Sequiviridae) (Li et al., Arch. Virol. 149: 1541-1558, 2004) . Aunque los autores reivindican que el vector de ALSV fue capaz de expresar la proteína verde fluorescente (GFP) por procesamiento de poliproteínas tras inoculación mecánica a plántulas de manzana, no se han presentado en el artículo pruebas experimentales convincentes de dicha capacidad. De forma similar, no están disponibles datos para apoyar reivindicaciones recientes de un vector “universal” basado en el geminivirus de la rizadura amarilla del tomate, que supuestamente es capaz de infectar de forma sistémica a una amplia diversidad de plantas de dicotiledóneas a monocotiledóneas a árboles y vides (Peretz et al., Plant Physiol. 145 (4) : 1251-1263, 2007) . Se ha desarrollado otro vector usando el virus A de la vid (GVA, un Vitivirus) . Su capacidad para expresar una proteína ajena se ha demostrado en tabaco (Haviv et al., J. Virol. Meth. 132: 227-231, 2006) y aún no se ha demostrado para la vid. Otro vector se basa en el virus de Citrus tristeza (CTV) , un closterovirus estrechamente relacionado con BYV (Folimonov et al., Virology 368 (1) : 205-216, 2007) . Sin embargo, el CTV solamente es útil en especies de Citrus, y su propagación implica un proceso incómodo de ciclos en protoplastos antes de la inoculación por corte de árboles cítricos con viriones aislados. En consecuencia, existe una fuerte necesidad de vectores virales adecuados para transformar plantas leñosas, particularmente vides.

Sumario La presente invención proporciona vectores de transferencia de genes vegetales, células vegetales, plantas y métodos como se exponen en las reivindicaciones.

La presente divulgación se refiere a vectores de transferencia de genes vegetales competentes para replicación que comprenden un ácido nucleico que codifica genes virales para virus asociados al enrollamiento de la vid 2 (LR-2) seleccionados del grupo que consiste en metiltransferasa, ARN helicasa, ARN polimerasa dependiente de ARN y p24; proteasas líder L1 y L2; y un polinucleótido heterólogo unido operativamente con... [Seguir leyendo]

1. Un vector de transferencia génica de plantas para silenciamiento génico inducido por virus, comprendiendo el vector un ácido nucleico que codifica:

a) genes virales de virus asociado con el enrollamiento de la vid 2 (LR-2) que comprenden metiltransferasa, ARN helicasa y ARN polimerasa dependiente de ARN; b) un supresor de ARNi; c) proteasas líder L1 y/o L2; y d) un polinucleótido heterólogo unido operativamente a un promotor, en el que el polinucleótido heterólogo se expresa en una célula vegetal,

en donde el vector de transferencia génica de plantas es competente para replicación y capaz de replicar de forma infecciosa en la célula vegetal, y el ácido nucleico codifica las proteasas líder L1 y L2, o en donde el vector de transferencia génica de plantas replica de forma condicionada y en donde al menos una proteasa líder seleccionada de L1 y L2 está inactivada de modo que el vector no pueda replicarse de forma infecciosa independientemente.

2. El vector de la reivindicación 1, que comprende además genes virales del virus asociado con el enrollamiento de la vid 2 (LR-2) que están implicados en el ensamblaje de viriones y/o el transporte dentro de plantas.

3. El vector de la reivindicación 2, en el que los genes virales se seleccionan del grupo que consiste en p6, Hsp70h, p63, CPm, CP y p19 del virus asociado con el enrollamiento de la vid 2 (LR-2) .

4. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el polinucleótido heterólogo codifica uno o más de una molécula indicadora, un marcador seleccionable o un gen terapéutico.

5. El vector de la reivindicación 4, en el que el gen terapéutico es antifúngico, antibacteriano, antiviral o un modificador del sabor.

6. El vector de la reivindicación 5, en el que el gen terapéutico es para el tratamiento de la enfermedad de Pierce o del oídio.

7. El vector de la reivindicación 6, en el que el gen terapéutico es un polinucleótido que desencadena el silenciamiento génico inducido por virus, un polinucleótido Run1, o codifica un polipéptido de lisozima.

8. El vector de la reivindicación 1, en el que las proteasas L1 y L2 son de LR-2.

9. El vector de la reivindicación 1, en el que el vector de transferencia génica de plantas es competente para replicación y capaz de replicar de forma infecciosa en la célula vegetal y el ácido nucleico codifica las proteasas líder L1 y L2, y en donde la proteasa L1 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº : 4.

10. El vector de la reivindicación 1, en el que el vector de transferencia génica de plantas es competente para replicación y capaz de replicar de forma infecciosa en la célula vegetal y el ácido nucleico codifica las proteasas líder L1 y L2, y en donde la proteasa L2 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº : 6.

11. El vector de la reivindicación 1, en el que el vector de transferencia génica de plantas replica de forma condicionada y en donde al menos una proteasa líder seleccionada de L1 y L2 está inactivada de modo que el vector no puede replicar de forma infecciosa independientemente, en donde la proteasa líder inactivada se selecciona de L1, L2 o tanto L1 como L2.

12. El vector de la reivindicación 1, en el que el supresor de supresor de ARNi es LR-2 p24.

13. El vector de la reivindicación 1, en el que el supresor de ARNi es virus del amarilleo de la remolacha p21.

14. Una célula vegetal que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

15. Una planta que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

16. Un método para expresar un gen heterólogo en una célula vegetal que comprende introducir en la célula vegetal el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

17. El método de la reivindicación 16, en el que introducir el vector en la célula vegetal comprende agroinoculación.

18. El método de la reivindicación 17, que comprende además injertar una parte de una planta que comprende la célula vegetal que comprende el vector en una parte de una planta que no comprende el vector.