Vacuna del VHB y procedimiento de preparación de la misma.

Una vacuna del VHB que comprende un antígeno de superficie del VHB completo recombinante (L-HBsAg) y antígeno del núcleo del VHB,

en la que el antígeno de superficie completo consiste en tres tipos de proteína de superficie (proteína L, proteína M y proteína S) y los antígenos preS producidos que consisten en preS1 y presS2 se localizan en la superficie externa de partículas formadas por enlaces entre antígenos S, y en la que la vacuna comprende alumbre y oro coloidal como un adyuvante

Vacuna del VHB y procedimiento de preparación de la misma Campo técnico La presente invención se refiere a una vacuna del virus de la hepatitis B (VHB) que comprende un antígeno de superficie de VHB completo recombinante que consiste en antígeno preS y antígeno S que comprende además un antígeno del núcleo del VHB además del antígeno de superficie completo, y a un procedimiento de preparación de la misma.

Técnica antecedente La infección por VHB provoca hepatitis aguda y hepatitis crónica. La mayoría de los individuos que tienen infección por VHB se recuperan completamente de la infección del virus después de 1 a 2 meses, pero aproximadamente el 10 % de ellos se convierten en pacientes de hepatitis crónica. Dependiendo de la edad de la infección, la velocidad con que se convierte en infección crónica es mucho peor, mostrando más del 95 % para los neonatos de menos de 2 meses, reduciéndose a medida que aumenta la edad, y llegando a aproximadamente el 25 % para niños de cinco años de edad. La infección crónica del VHB provoca mayor riesgo de desarrollo de cirrosis hepática y cáncer. El antígeno de superficie del VHB (HBsAg) se detecta en la sangre de pacientes con infección crónica de VHB, sin embargo, el anticuerpo anti HBsAg no aparece debido al desarrollo de tolerancia inmunitaria. Por lo tanto, el objetivo final para el tratamiento de la infección de VHB crónica es inducir anticuerpos anti HBsAg en el suero y eliminar el VHB de la sangre y el hígado.

La vacuna terapéutica descrita en la presente invención es adecuada para el tratamiento de infección crónica de VHB, por que detiene la tolerancia inmunitaria e induce respuesta inmunitaria contra el VHB para eliminar antígeno del VHB de la sangre. Las vacunas terapéuticas contra la infección crónica de VHB deberían cumplir los siguientes criterios; deben ser capaces de interrumpir la tolerancia inmunitaria e inducir respuestas inmunitarias contra el VHB, inducir fuerte inmunidad humoral y mediada por células para resolver la infección viral crónica.

Después de la infección por VHB, cuando se induzcan respuestas inmunitarias policlonales, se resolvería la infección. Por otro lado cuando se indujeran respuestas inmunitarias oligoclonales débiles, la infección conduciría a infección crónica. Este hallazgo sugiere que una vacuna terapéutica debe contener antígenos capaces de proporcionar diversos epítopos necesarios para inducir respuesta inmunitaria policlonal.

El gen del antígeno de la envoltura del VHB consiste en región preS (preS1 y preS2) y S, y después de la transcripción, se sintetizan tres proteínas de la envoltura (proteína L, proteína M y proteína S) por traducción alternativa en cada uno de los tres codones de inicio. La proteína L consiste en aproximadamente 400 aminoácidos dependiendo del subtipo de VHB, que comprende el dominio preS 1, dominio preS2 y dominio S, cuyo inicio de la traducción comienza en el codón AUG de preS1. La proteína M consiste en aproximadamente 281 aminoácidos, que comprenden el dominio preS2 y dominio S, cuyo inicio de la traducción comienza en preS2. La proteína S consiste en aproximadamente 226 aminoácidos, que comprenden solamente el dominio S, y compone la parte más abundante en las partículas del virus. Los dominios S de estas proteínas de envoltura se incluyen en la membrana lipídica y forman partículas de 22 nm y 42 nm y forma de bastón dependiendo de la relación de tres proteínas de envoltura de tamaños diferentes. Los dominios preS1 y preS2 contenidos en proteínas M y L son altamente inmunogénicos y ayudan a inducir anticuerpos específicos de proteína S en ciertas cepas de ratones congénicas en las que la proteína S por sí sola no es inmunogénica.

Como se ha descrito anteriormente, es importante proporcionar conjuntos completos de epítopos específicos de antígenos de la envoltura y antígeno de VHB como formas de partículas altamente inmunogénicas, el desarrollo de una vacuna de VHB que contiene la proteína preS completa y proteína S es el objetivo de la presente invención. En particular, experimentos tanto animales como humanos han mostrado que la vacuna que contiene antígenos tanto preS como S puede inducir respuestas inmunitarias más fuertes y respuestas mucho más rápidas que la vacuna que contiene solamente antígeno S. Es decir, la vacuna que contiene antígenos tanto preS como S es más inmunogénica e induce respuestas inmunitarias rápidas, en comparación con la vacuna que contiene solamente antígenos S, mostrando de este modo que la proteína L es más útil como una vacuna terapéutica para el tratamiento de hepatitis B crónica.

Sin embargo, la mayoría de las vacunas de VHB disponibles en el mercado contienen solamente proteína S. Esto podría deberse a que la expresión de proteína L en formas de partícula vistas en el paciente con VHB crónico no ha tenido éxito a partir de sistemas de expresión de células eucariotas tales como Saccharomyces cerevisiae o Hansenula polymorpha.

Además, ha habido intentos de coexpresar una parte del antígeno preS (en particular, preS2) y el antígeno S en células eucariotas tales como Saccharomyces cerevisiae o Hansenula polymorpha, sin embargo, no se descubrió que los productos tuvieran suficiente inmunogenicidad.

Además, ha habido otros intentos de producir antígenos de VHB, en los que el gen de preS se expresó por separado

para producir el antígeno preS solamente, y después se mezcló con antígeno S. Sin embargo, la forma soluble lineal producida de antígeno preS no fue m uy inmunogénica. Por lo tanto, el intento de mejorar la inmunogenicidad no tuvo éxito en comparación con el antígeno de superficie completo, en el que el antígeno preS y antígeno S se coexpresan en formas de partículas y los antígenos preS se localizan en la superficie externa de las partículas.

En consecuencia, para mejorar la inmunogenicidad, hay que expresar simultáneamente los antígenos preS y S, y hay que localizar los antígenos preS en la superficie externa de partículas que consisten en antígenos S. Recientemente, Scigen ha desarrollado una vacuna de VHB en Israel y afirman que contiene el antígeno de superficie completa, es decir, los antígenos tanto preS como S.

Divulgación de la invención Problema técnico Los presentes inventores han desarrollado con éxito una línea celular CHO que puede producir antígeno de la envoltura del VHB que contiene antígenos preS y S en formas de partícula. Han descubierto que, cuando el gen de envoltura completo del virus de la hepatitis B se introdujo en un vector específico, se expresaban los tres tipos de proteínas de superficie (proteína L, proteína M y proteína S) en las formas de partículas vistas en la sangre de pacientes con VHB crónico. Usando este antígeno, se ha desarrollado una vacuna de VHB fuerte que comprende el antígeno de superficie completo recombinante, y además se ha descubierto que es altamente eficaz en la inducción de respuestas inmunitarias fuertes en un ratón transgénico que produce antígeno de VHB en la sangre pero sin ninguna cantidad detectable de anticuerpo específico de VHB.

Solución técnica Es un objeto de la presente invención proporcionar una vacuna de VHB que comprenda antígeno de superficie completo que consiste en tres tipos de proteínas de superficie (proteína L, proteína M y proteína S) en formas de partícula.

Preferentemente, es un objeto de la presente invención proporcionar la vacuna que comprende un antígeno de superficie de VHB, en el que la proteína L, la proteína M y la proteína S se coexpresan de un vector de expresión que comprende el gen de envoltura completo que codifica los antígenos preS1, presS2 y S del virus de la hepatitis B, y los antígenos preS producidos se localizan en la superficie externa de partículas formadas por estos antígenos.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para preparar una vacuna de VHB potente.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un vector de expresión recombinante capaz de expresar los tres tipos de proteína de superficie (proteína L, proteína M y proteína S) .

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una célula transformada con el vector de expresión recombinante.

Es otro objeto más de la presente invención proporcionar una terapia inmunitaria adecuada par tratar la infección por VHB crónica como una forma de vacuna de VHB.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una vacuna multiantígeno de VHB para potenciar la inmunidad

tanto humoral como mediada por células preparada añadiendo un antígeno del núcleo de VHB recombinante y/o adyuvante a la vacuna.

Breve... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna del VHB que comprende un antígeno de superficie del VHB completo recombinante (L-HBsAg) y antígeno del núcleo del VHB, en la que el antígeno de superficie completo consiste en tres tipos de proteína de superficie (proteína L, proteína M y proteína S) y los antígenos preS producidos que consisten en preS1 y presS2 se localizan en la superficie externa de partículas formadas por enlaces entre antígenos S, y en la que la vacuna comprende alumbre y oro coloidal como un adyuvante.

2. La vacuna del VHB de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el antígeno del núcleo del VHB es obtienido cultivando E. coli transformadas con un vector de expresión recombinante que comprende un nucleótido que codifica el antígeno del núcleo del VHB, en el que preferentemente el nucleótido que codifica el antígeno del núcleo de VHB

tiene una secuencia de bases de SEC ID Nº : 6.

3. Un procedimiento para preparar la vacuna del VHB de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

1) introducir un polinucleótido que tiene una región codificante para el gen de la envoltura del VHB completo y un nucleótido 3’-UTR completo que contiene un sitio de poliadenilación en un vector pSGM depositado con el

número de referencia: KCCM 10202; 2) transformar una célula animal con el vector de expresión de la etapa 1) ; y 3) cultivar la célula animal transformada para recuperar una proteína de antígeno de superficie completo del VHB recombinante (L-HBsAg) ; 4) introducir un polinucleótido que codifica un antígeno del núcleo del VHB en un vector de expresión;

5) transformar una célula huésped con el vector de expresión de la etapa 4) ; 6) cultivar la célula huésped transformada para recuperar una proteína del núcleo del VHB recombinante; y 7) mezclar el antígeno de superficie completo del VHB obtenido en la etapa 3) y la proteína del antígeno del núcleo del VHB obtenida en la etapa 6) con alumbre y oro coloidal como un adyuvante.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el polinucleótido de la etapa 1) tiene una 25 secuencias de bases de SEC ID Nº : 1 y/o la célula animal es una célula CHO.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la célula animal transformada de la etapa 3) es un transformante depositado con el número de referencia KCTC 11058BP.

6. La vacuna del VHB de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proteína L, proteína M y proteína S son coexpresadas de un vector de expresión, en la que el vector de expresión es preparado insertando una región

codificante para gen de la envoltura del VHB completo y un nucleótido 3’-UTR completo que contiene un sitio de poliadenilación en un vector pSGM depositado con el número de referencia KCCM 10202.

7. La vacuna del VHB de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la región codificante para el gen de la envoltura del VHB y nucleótido 3’-UTR completo que contiene un sitio de poliadenilación tiene una secuencia de bases de SEC ID Nº : 1.