Uso de NKp46 para prevenir la diabetes tipo I.

Una composicion que comprende, al menos, una proteina y un portador farmaceuticamente aceptable,

en la que la proteina se selecciona del grupo formado por:

una proteina que comprende un fragmento aislado de la region extracelular de NKp46;

un anticuerpo especifico para la region extracelular de NKp46,y

una combinacion de los mismos,

para su uso en la prevencion o el tratamiento de la diabetes tipo 1.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere al uso del receptor de citotoxicidad natural NKp46 para prevenir y tratar la diabetes, incluyendo la diabetes tipo I (DTI) y la diabetes tipo 2. En particular, la invención presenta composiciones que comprenden un fragmento de la región extracelular de NKp46 para prevenir la aparición y progresión de la diabetes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La diabetes tipo 1 (DT1; también conocida como diabetes mellitas tipo 1 y diabetes inmunomediada) es una enfermedad autoinmune multifactorial en la que las células beta productoras de insulina en los islotes pancreáticos son destruidas por células T autorreactivas. Las células mononucleares se infiltran en los islotes pancreáticos de Langerhans durante un periodo variable de inflamación clínicamente silenciosa (insulitis) , y finalmente las células T destruyen las células beta productoras de insulina. La diabetes tipo 1 completa se produce cuando se destruyen la mayoría de células beta y el páncreas deja de producir suficiente insulina. La insulina exógena debe entonces administrarse de por vida. Semanas o meses después de que comience el tratamiento de insulina, los pacientes con diabetes tipo 1 pueden experimentar un periodo variable de remisión, que se cree que da lugar a la producción restaurada de insulina por las células beta residuales. Es necesario un tratamiento continuado con insulina exógena para preservar las células beta residuales, que todavía son capaces de modular de forma natural el metabolismo de la glucosa.

La diabetes tipo 2 se caracteriza por la resistencia a la insulina que puede combinarse con la secreción reducida de insulina. Se cree que la reactividad defectuosa a la insulina implica al receptor de insulina. En la etapa temprana de la diabetes tipo 2, la hiperglucemia puede retroceder mediante diversas medidas y medicaciones que mejoran la sensibilidad a la insulina o reducen la producción de glucosa por el hígado. A medida que la enfermedad progresa, se produce el deterioro de la secreción de insulina, y se requiere a menudo un reemplazo terapéutico de insulina. La destrucción de las células beta se produce también en la diabetes tipo 2, y se ha propuesto que un factor contribuyente se aumente en la apoptosis de las células beta (Rhodes Science 2005 Jan 21; 307 (5708) : 380 -4) .

Un modelo ampliamente utilizado de DT1 autoinmune es el ratón diabético no obeso (NOD) , que desarrolla espontáneamente la diabetes después de un periodo variable de insulitis, de manera similar a la DT1 humana. Los ratones NOD muestran insulitis a partir de 4 – 5 semanas de edad, y después de un periodo variable de inflamación crónica, la diabetes se desarrolla aproximadamente a las 10 – 20 semanas, con la mayoría de las hembras diabéticas a las 30 semanas (1, 2) . Un modelo aceptado adicional de diabetes autoinmune experimental en ratones es la inducción de diabetes mediante múltiples inyecciones de bajas dosis de estreptozotocina (LDST) (3, 4) . La estreptozotocina causa la diabetes por la citotoxicidad directa de las células beta, así como por la iniciación de la reacción autoinmune mediada celular contra las células beta (4, 5) . La transferencia adoptiva de los esplenocitos activados de los ratones tratados con LDST ha sido revelada para inducir la diabetes en ratones sanos sin tratamiento alguno (5) .

Se considera que la TD1 es una enfermedad mediada por las células T. Sin embargo, varios estudios sugieren que el sistema inmune innato, en particular las células asesinas naturales (NK) , desempeñan un papel en la patogénesis de la enfermedad. Por ejemplo, se ha revelado que las células NK se infiltran en los islotes de los ratones NOD (7) , y se ha informado que la inflamación del islote fue mediada principalmente por las células NK en TD1 humana (8) . Han sido reveladas diversas alteraciones en los comportamientos de las células NK en pacientes con DT1, tanto en el inicio de la enfermedad como después de la hiperglucemia a largo plazo (9) . Además, se demostró el papel esencial de las células NK en el desarrollo de la diabetes en modelos murinos con DT1 acelerada (10, 11) . Poirot et al., 2004 revelaron que la proporción y el número de células NK, y el momento de su entrada en el páncreas se correlacionan con la gravedad de la DT1 en ratones NOD transgénicos (10) . Asimismo se ha revelado que la depleción de células NK en modelos de ratones NOD transgénicos con DT1 acelerada inhibe de manera significativa el desarrollo de la diabetes (10, 11) . Sin embargo, los mecanismos moleculares de la implicación de las células NK en la DT1 son aún desconocidos.

Las células NK desempeñan un papel crucial en la defensa inicial contra las células infectadas por virus y las células cancerígenas (12) . Interactúan con células presentadoras de antígeno (CPAs) , sirven como CPAs para asesinar directamente a las células peligrosas y además secretan a las quimiocinas y a las citocinas inmunomoduladoras como IFN – γ e IFN – α, causando que las células T se cambien a un fenotipo Th1 (13, 14) .

Las células NK reconocen células diana a través de una diversidad de receptores activadores y un equilibrio delicado entre las señales inhibitorias y activadoras que regulan fuertemente su activación (15 – 17) . Las células NK se han identificado en órganos diana de pacientes que padecen enfermedades autoinmunes (18) y son capaces de atacar a las células autólogas (19 – 21) .

La destrucción mediada por las células NK implica varios receptores de activación, como los receptores de citotoxicidad natural (NCRs) NKp30, NKp44, NKp46, y NKG2D. NKp30, NKp44 y NKp46 expresados casi exclusivamente en las células NK, mientras que NKG2D se expresa en tipos adicionales de linfocitos como las células T CD8+ (22) . Se considera que NKp46 es el marcador NK más específico en el que se ha descubierto una proteína ortóloga (RCN-1) en ratones (23, 24) .

Pessino et al., 1998 revelan la clonación molecular de NKp46 y su papel en la citotoxicidad mediada (Pessino et al., J Exp Med 1998; 188: 953 – 960) .

Algunos de los inventores de la presente invención han revelado que las proteínas de fusión (Ig) de inmunoglobulina NKp46 y NKp44, pero no una proteína de fusión (Ig) NKp30, se unen específicamente a la hemaglutinina del virus de la gripe y a la hemaglutinina – neuraminidasa del virus Sendai (29, 45, 46) . Según estas divulgaciones, esta interacción es funcional y puede mediar una mayor destrucción de células infectadas. Además, la destrucción mejorada puede ser abolida por anticuerpos que bloquean la HA o los receptores NKp46 y NKp44.

El receptor NKp46 humano tiene múltiples isoformas incluyendo la isoforma a (número de acceso GenBank CAA04714) ; isoforma b (número de acceso GenBank CAA06872) ; isoforma c (número de acceso GenBank CAA06873) , e isoforma d (número de acceso GenBank CAA06874) . En general, el receptor NKp46 comprende dos dominios similares a la Ig extracelular del tipo C2, una parte de transmembrana y un segmento intracelular. La parte extracelular de NKp46 comprende un dominio D1 designado NKp46D1 (correspondiente a los residuos 22 – 120 de la proteína completa madura de la isoforma a) , y un dominio D2 designado NKp46D2 que comprende 134 residuos de aminoácidos (correspondientes a los residuos 121 – 254 de la proteína completa de la isoforma a) .

La publicación de la solicitud PCT Nº WO 02 / 08287 de algunos de los presentes inventores revela un complejo diana que comprende un segmento de reconocimiento diana que comprende NKp30, NKp44 y NKp46 o un fragmento funcional de los mismos; y un segmento activo que comprende una sustancia activa como un resto citotóxico, un resto de imagen o un fragmento de Ig. Según la divulgación, las proteínas de fusión que contienen los dominios extracelulares NKp30, NKp44 o NKp46 fusionados a la parte Fc de la IgG1 humana (denominado respectivamente NKp30 – Ig, NKp44 – Ig y NKp46 – Ig) , se unen a varias dianas de células tumorales, y NKp46 – Ig se une a las células infectadas por virus. Se reveló además que son proteínas de fusión que contienen D1 o D2 fusionado a la parte Fc de la IgG1 humana (denominado respectivamente NKp46D1 – Ig y NKp46D2 – Ig) , y se observó que D2 es responsable de la interacción con la hemaglutinina viral.

La publicación de solicitud PCT Nº WO 2004 / 053054 de algunos de los presentes inventores revela que un conjugado de NKp30 – Ig es eficaz en la inducción de la regresión del tumor in vivo en ratones desnudos portadores de cáncer. Además, se reveló que son composiciones farmacéuticas que comprenden un primer segmento... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende, al menos, una proteína y un portador farmacéuticamente aceptable, en la que la proteína se selecciona del grupo formado por:

una proteína que comprende un fragmento aislado de la región extracelular de NKp46; un anticuerpo específico para la región extracelular de NKp46, y una combinación de los mismos,

para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes tipo 1.

2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que la proteína es una proteína que comprende un fragmento aislado de la región extracelular de NKp46; o en la que la NKp46 es NKp46 humana, preferiblemente en el que la NKp46 humana es una isoforma seleccionada del grupo formado por una isoforma a, una isoforma b, una isoforma c y una isoforma d.

3. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el fragmento aislado de la región extracelular de NKp46 comprende el dominio D2 o un fragmento del mismo.

4. La composición para su uso según la reivindicación 3, en la que el fragmento aislado está sustancialmente desprovisto del dominio D1; o en la que el fragmento aislado comprende el dominio D2 o un fragmento del mismo, y un fragmento del dominio D1; o en la que el dominio D2 se selecciona del grupo formado por la SEQ ID Nº : 1; SEQ ID N º : 2; SEQ ID N º : 3; SEQ ID Nº : 4; SEQ ID Nº : 9 y SEQ ID Nº : 10; o en la que el fragmento aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID NOS: 1-10; o en la que el fragmento aislado corresponde a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID NOS: 1-10; o en la que el fragmento aislado comprende una variante de dominio D2, en la que la variante comprende al menos una sustitución de aminoácidos en el dominio D2, preferiblemente en la que la sustitución de al menos un ácido amino está en un residuo seleccionado del grupo formado por treonina 125, treonina 225, lisina 157, lisina 170, arginina 160, arginina 166, histidina 163, asparagina 216, y una combinación de los mismos, en la que los números corresponden a las posiciones de los residuos de la SEQ ID Nº : 29, más preferiblemente en la que la sustitución de aminoácidos se selecciona entre el grupo formado por T125A; T225A; T225S; T225N; N216A; K157Q; R160Q; H163Q; R166Q; K170T y una combinación de los mismos, en la que los números corresponden a las posiciones de los residuos de NKp46 de la SEQ ID Nº : 29; o, alternativamente, preferiblemente en el que la variante de dominio D2 se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID Nº : 12 – 16.

5. La composición para su uso según la reivindicación 3, en la que la proteína que comprende un fragmento aislado de la región extracelular de NKp46 se selecciona del grupo formado por una proteína de fusión y un conjugado de proteína.

6. La composición para su uso según la reivindicación 5, en la que la proteína de fusión comprende un primer segmento y un segundo segmento, en la que el primer segmento comprende el dominio D2 o un fragmento del mismo, y en la que el segundo segmento comprende al menos una proteína heteróloga seleccionada del grupo formado por: una inmunoglobulina, una citoquina, una proteína inmunomoduladora o péptido, un receptor de NK distinta de NKp46, una hormona, un factor de crecimiento y fragmentos de los mismos.

7. La composición para su uso según la reivindicación 6, en la que la proteína heteróloga es un fragmento de inmunoglobulina, preferiblemente en la que el fragmento de inmunoglobulina es la región Fc de la IgG1 o, alternativamente, preferiblemente en la que el dominio D2 o fragmento de la misma se selecciona del grupo formado por las SEQ ID Nº : 1 -10 .

12. 16; o en la que la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID Nº .

17. 22; o en la que la proteína de fusión comprende una variante del dominio D2 como primer segmento, en la que la variante comprende al menos una sustitución de aminoácidos en el dominio D2 en un residuo seleccionado del grupo formado por treonina 125, treonina 225, lisina 157, lisina 170, arginina 160, arginina 166, histidina 163, asparagina 216, y una combinación de los mismos; en la que los números corresponden a las posiciones de los residuos de la SEQ ID Nº : 29; preferiblemente en la que la proteína de fusión comprende la región Fc de la IgG1 como segundo segmento; más preferiblemente en la que el primer segmento comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por las SEQ ID Nº .

12. 16; o en la que la citoquina se selecciona del grupo formado por IL -2, IL -4 e IL -10; o en el que la proteína inmunomoduladora o péptido se selecciona del grupo formado por la proteína de choque térmico 60 (Hsp60) o un fragmento de la misma, roquinimex, el antígeno de fijación al complemento de fiebre Q (QFA) , anticuerpo antiCD3 y una combinación de los mismos; o en la que el receptor de NK diferente de NKp46 es NKG2D; o en la que la hormona se selecciona del grupo formado por insulina, glucagón y una combinación de los mismos.

8. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que la composición comprende un anticuerpo específico para la región extracelular de NKp46 en el que el anticuerpo es un anticuerpo sin deplecionar.

9. La composición para su uso según la reivindicación 8 en la que el anticuerpo es específico para el dominio D2.

10. La composición para su uso según la reivindicación 9, en la que el anticuerpo se selecciona del grupo formado por un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo de cadena sencilla y un anticuerpo humanizado; o en la que la composición comprende tanto una proteína que comprende un fragmento aislado de la región extracelular de NKp46; como un anticuerpo específico para la región extracelular de NKp46, en la que el anticuerpo es un anticuerpo sin deplecionar.

11. La composición para su uso según la reivindicación 1, en la que la diabetes tipo 1 se selecciona del grupo formado por preinsulitis, insulitis temprana, prediabetes, diabetes manifiesta y una combinación de los mismos.

12. La composición para su uso según la reivindicación 11, en donde la composición se administra después de la detección de al menos uno de los niveles de glucosa en ayunas en sangre y de los niveles de tolerancia a la glucosa en la materia; o donde se determinan antes de y después de la administración de la composición que comprende además al menos uno de los niveles de glucosa en sangre en ayunas y los niveles de tolerancia a la glucosa en el sujeto; o en la que la composición se administra como una sola dosis o de dosis múltiples, preferiblemente en múltiples dosis a intervalos semanales; o en la que la composición se administra por una vía seleccionada de entre el grupo que consiste en administración parenteral, oral, transdérmica y tópica; o en la que la composición se administra en combinación con al menos un agente inmunomodulador o inmunoestimulador, preferiblemente en la que el agente inmunomodulador o inmunoestimulador se selecciona del grupo formado por bacilo de Calmette -Guérin (BCG) , proteína de choque térmico 60 (Hsp60) o un fragmentos de la misma, roquinimex, antígeno al complemento de fiebre Q (QFA) , anticuerpo antiCD3, α -galactosliceramida, un adyuvante y una combinación de los mismos.

13. Una proteína que comprende un fragmento aislado de la región extracelular de NKp46 para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes tipo 1.

14. Un anticuerpo específico para la región extracelular de NKp46 para su uso en la prevención o el tratamiento de la diabetes tipo 1, en la que el anticuerpo es un anticuerpo sin deplecionar.