Uso de la Garvicina A como producto antimicrobiano.

Uso de la Garvicina A como producto antimicrobiano.

La invención consiste en el uso de la Garvicina A como producto antimicrobiano la forma de obtención de la Garvicina A mediante aislamiento natural o de manera recombinante,

así como la aplicación de formulaciones que comprenden Garvicina A como compuesto antimicrobiano de uso en salud animal, salud humana e industria alimentaria.

Uso de la Garvicina A como producto antimicrobiano SECTOR DE LA TÉCNICA:

La alta especificidad y gran actividad de la Garvicina A hace que esta 5 bacteriocina tenga una utilización potencial, tanto en acuicultura como en la industria alimentaria, inhibiendo el crecimiento de cepas de Lactococcus garvieae (L. garvieae) patógenas para el hombre y/o los animales susceptibles.

En el caso de la acuicultura, la especificidad de la Garvicina A asegura que su ío utilización no afectaría a la microbiota intestinal de los peces, y que no interferiría con la actividad de las especies bacterianas utilizadas como probióticos como Lactobacillus spp., que se podrían aplicar de forma simultánea.

En el caso de los alimentos, la utilización de esta bacteriocina podría evitar la 15 contaminación de los mismos con cepas patógenas de L. garvieae, que podrían estar implicadas en el desarrollo de casos clínicos en humanos, sin por ello inhibir el desarrollo de otras bacterias lácticas implicadas en las características organolépticas y en la elaboración de productos alimentarios.

ESTADO DE LA TÉCNICA:

La lactococosis de la trucha, cuyo agente etiológico es L garvieae, es una enfermedad de gran importancia económica y sanitaria en la acuicultura de los países mediterráneos. España es uno de los principales países productores de trucha en la Unión Europea, ocupando el primer puesto en 25 cuanto al nivel de producción y el quinto respecto a su valor (Informe

APROMAR, 2008). La lactococosis afecta de forma significativa a esta producción, debido a la mortalidad inducida en la trucha (superior al 50%), la disminución de la tasa de crecimiento de los animales y la imposibilidad de comercializar los peces afectados (Vendrell et al., 2006). Otras especies de

peces afectadas por L. garvieae son la anguila, el serióla y el pez gato.

Además, L. garvieae es capaz de infectar a otras especies animales y a humanos, y por ello es considerado un agente con potencial zoonósico. L

garvieae es responsable de mastitis en ganado vacuno y búfalos (Teixeira et al., 1996), y de procesos neumónicos en ganado porcino (Tejedor et al., 2011). También se aísla frecuentemente de productos lácteos (quesos de fabricación artesanal), carne de cerdo y de pollo, y de verduras (Santos et al, 2005; Kawanishi et al., 2007, Foschino et al., 2008). En el hombre, L. garvieae da lugar de forma esporádica a distintos procesos clínicos (Fefer et al., 1998, Wang etal, 2007).

En la trucha, la lactococosis es una enfermedad septicémica generalizada que muestra una acusada estacionalidad. Está asociada a un aumento en la temperatura del agua, favorecida por deficiencias en la calidad del agua (Ghittino y Múzquiz, 1998, Vendrell et al., 2006) y cursa con un alto porcentaje de mortalidad (50-80% de la producción). También es de señalar que L. garvieae puede permanecer durante largo tiempo en el agua sin perder viabilidad, contribuyendo de este modo al mantenimiento de la infección en las instalaciones y a su diseminación (Vendrell et al., 2006). El tratamiento de esta enfermedad requiere la administración de antibióticos que resultan caros, difíciles de aplicar y en muchos casos son ineficaces debido a la aparición cada vez más frecuente de cepas de L. garvieae multirresistentes. En la actualidad, las medidas preventivas dirigidas contra la lactococosis en peces consisten en la utilización de vacunas y probióticos (Vendrell et al., 2007 y 2008). Sin embargo, aunque la vacuna comercial resulta efectiva, es costosa económicamente y requiere medidas de manejo estresantes para los peces y complicadas en su aplicación. Por otra parte, aunque los probióticos estimulan la respuesta inmune de los peces, no se ha demostrado que sean totalmente efectivos frente a la infección por L. garvieae.

Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos sintetizados por diversas bacterias, y que presentan la capacidad de inhibir el crecimiento de bacterias similares o de cepas de la misma especie de la bacteria productora. En la actualidad, la nisina, una bacteriocina producida por Lactococcus lactis, es empleada como conservante en la industria alimentaria (Delves-Broughton, 1990), en especial en la prevención de las posibles alteraciones del queso y de diversas carnes (tanto crudas como pre-cocinadas), mostrando efectividad

frente a varias bacterias Gram positivas, como Clostridium spp., Listeria monocytogenes y diversas bacterias lácticas.

Hasta el momento sólo se han descrito tres bacteriocinas producidas por L garvieae: Garviecin L1-5 (Villani et al., 2001), Garvicin ML (Borrero et al, 2011) y Garvieacin Q (Tosukhowong et al., 2012). Todas estas bacteriocinas inhiben, en mayor o menor medida, el crecimiento tanto de L. garvieae como de otras bacterias Gram positivas, como Enterococcus faecium, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Pediococcus spp, Lactobacillus casei, Lactobacillus sakei, Propionibacterium spp., Clostridium spp., Streptococcus pneumoniae y Lactococcus lactis.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN:

Usode la Garvicina A como producto antimicrobiano.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un producto que contiene al menos, un péptido llamado Garvicina A, que tiene actividad antimicrobiana y que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 1, teniendo en cuenta que los aminoácidos que componen el péptido se seleccionan independientemente de los isómeros D o L.

Así mismo, la invención incluye formulaciones que incluyen fragmentos de dicho péptido de, al menos, 22 aminoácidos y sus derivados que presentan al menos un 55% de identidad con los aminoácidos de la secuencia descrita en SEQ ID NO: 1, comprenden al menos una glicosilación, una amidación, una acilación, una acetilación, una metilación, o llevan un grupo protector, presentando dichos fragmentos y derivados una actividad antimicrobiana

Otro aspecto de la invención se refiere a un producto que contiene un polipéptldo que comprende un péptido definido en los dos párrafos anteriores.

Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o un polipéptido según se han descrito en los párrafos anteriores. También se refiere a una construcción de ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido de los descritos aquí, en la que el ácido nucleico está enlazado a una o más secuencias control que

dirigen la producción de dichos péptidos en una hospedador adecuado, e incluye , así mismo, vectores de expresión recombinante, células u organismos hospedadores que comprenden dicha construcción de ácidos nucleicos.

La invención también se refiere a un método para producir uno de los péptidos o polipéptidos de la invención, que comprende: cultivar células u organismos hospedadores recombinantes o células de cualquiera de las cepas descritas en la invención bajo condiciones adecuadas para la producción del péptido o polipéptido; recolectar dichas células u organismos o tomar una muestra del medio de cultivo de las células o del cuerpo del organismo y, si procede; preparar un extracto crudo o extracto clarificado homogeneizado; y, si procede, enriquecer el nivel de pureza del péptido o polipéptido en el extracto homogeneizado o extracto crudo; y, si procede, añadir una o varias sustancias que modifiquen las propiedades fisicoquímicas de la formulación final. Entre las células y organismos hospedadores que se pueden utilizar en dicho método, se encuentran las células de insectos, larvas de insectos o insectos en estado pupa.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de dicha composición como bactericida o bacteriostático para aplicaciones en la industria alimentaria, especialmente en alimentación animal, y/o como agente profiláctico y/o terapéutico en acuicultura o en otra producción ganadera, frente a enfermedades infecciosas producidas por Lactococcus garvieae, otras lactococcosis u otras enfermedades.

Como consecuencia de la secuenciación de una cepa de L. garvieae en nuestro laboratorio (Aguado-Urda et al., 2011), se han caracterizado a nivel molecular las secuencias de ADN de los cinco plásmidos que forman el genoma completo de la cepa 21881 de L garvieae (Aguado-Urda et al., 2012). La cepa 21881 de L. garvieae ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, Edificio de Investigación, 46100 Burjassot (Valencia) donde le ha sido asignado el número de depósito CECT8279. El análisis de los posibles ORFs correspondientes a los plásmidos pGL1 (4.536 bp), pGL2 (4.572 bp) y

pGL5 (68.798 bp), muestra la existencia de genes que podrían codificar tres posibles bacteriocinas (Figura... [Seguir leyendo]

1.- Uso de la Garvicina A, que consiste en la secuencia de aminoácidos 5 descrita en SEQ ID NO:1, en el que los aminoácidos que componen el

péptido se seleccionan independientemente de los isómeros D o L., para preparar una composición con propiedades antimicrobianas.

2.- Composición antimicrobiana que incluye como principio activo Garvicina A o fragmentos de al menos 22 aminoácidos de su secuencia descrita en SEQ

ío ID NO:1 y sus derivados, caracterizados porque presentan al menos un 55% de identidad con los aminoácidos de la secuencia descrita en SEQ ID NO:1, comprenden al menos una glicosilación, una amidación, una acilación, una acetilación, una metilación, o llevan un grupo protector, presentando dichos fragmentos y derivados una actividad antimicrobiana.

3.- Una composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 2 donde

los péptidos o polipéptidos se obtienen de manera recombinante.

4.- Una composición de acuerdo con las reivindicaciones 2 y 3 que comprende una célula u organismo hospedador recombinante capaz de producir la Garvicina A de secuencia ID NO:1.

5.- Una composición antimicrobiana de acuerdo a la reivindicación 4

comprendiendo la cepa L. garvieae de forma natural y/o la cepa L lactis en forma transformada, con cualquiera de los genes del operón Ign AICD.

6.- Un proceso para la producción de Garvicina A de secuencia ID NO:1 o fragmentos de al menos 22 aminoácidos de su secuencia descrita en SEQ ID 25 NO:1 y sus derivados que comprende: cultivar células u organismos

hospedadores recombinantes, bajo condiciones adecuadas para la producción del péptido o polipéptido; recolectar dichas células u organismos o tomar una muestra del medio de cultivo de las células o del cuerpo del organismo y, si procede, preparar un extracto crudo o extracto clarificado 30 homogeneizado; y, si procede, enriquecer el nivel de pureza del péptido o

polipéptido en el extracto homogeneizado o extracto crudo; y, si procede,

añadir una o varias sustancias que modifiquen las propiedades fisicoquímicas de la formulación final.

7.- El proceso, de acuerdo con la reivindicación 6, donde las células hospedadoras u organismos hospedadores son células de insectos, larvas de 5 insectos o insectos en estado pupa.

8- Un proceso para la producción de una composición antimicrobiana de acuerdo a las reivindicaciones 2-5, donde los péptidos o polipéptidos definidos se obtienen a través de un proceso fermentativo por el cultivo de cepas L. garvieae de forma natural y/o L. lactis de forma transformada con ío cualquiera de los genes del operón Ign AICD, bajo las condiciones adecuadas para la producción de la Garvicina A o de la composición antimicrobiana.

9.- El uso de la Garvicina A o de la composición antimicrobiana de las reivindicaciones 2-5 para la producción de un producto que tiene actividad bactericida o bacteriostática.

10.- El uso de la Garvicina A o de la composición antimicrobiana de las

reivindicaciones 2-5 como agente bactericida o bacteriostático de aplicación en la industria alimentaria.

11.- El uso de la Garvicina A o de la composición antimicrobiana de las reivindicaciones 2-5 para la producción de un producto antimicrobiano como

agente profiláctico y/o terapéutico.

12.- El uso de la Garvicina A o de la composición antimicrobiana de las reivindicaciones 2-5 para la producción de un producto antimicrobiano como agente profiláctico y/o terapéutico para aplicación en acuicultura o en otra producción ganadera.

13.- El uso de la Garvicina A o de la composición antimicrobiana de las

reivindicaciones 2-5 para la producción de un producto antimicrobiano como agente profiláctico y/o terapéutico para aplicación en salud humana..

14.- El uso de la Garvicina A o de la composición antimicrobiana de las reivindicaciones 2-5 para la producción de un producto antimicrobiano como 30 agente bactericida o bacteriostático para aplicación en alimentación animal.