Sondas de ácido nucleico y métodos para detectar parásitos de Plasmodium.

Un método para detectar la presencia de Plasmodium en una muestra,

comprendiendo dicho método las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra con una sonda de ácido nucleico para detectar Plasmodium en un ensayo de hibridación, donde dicha sonda discrimina entre especies de Plasmodium, en las condiciones que permitan que dicha sonda se hibride con ácido nucleico de Plasmodium, donde dicha sonda se selecciona de un grupo que consiste en las sondas de SEQ ID NO.: 1 para detectar PGenus1, SEQ ID NO.: 3 para detectar MalF1, SEQ ID NO.: 4 para detectar MalF2, SEQ ID NO.: 5 para detectar Mal1.8F, SEQ ID NO.: 6 para detectar Mal1.8R, SEQ ID NO.: 7 para detectar PV1, SEQ ID NO.: 8 para detectar PV2, SEQ ID NO.: 10 para detectar PF2, SEQ ID NO.: 11 para detectar PF3, SEQ ID NO.: 12 para detectar PF4, SEQ ID NO.: 13 para detectar PF5, y SEQ ID NO.: 14 para detectar PM1 o sus secuencias complementarias; y

b) detectar dicha sonda unida a dicho ácido nucleico de Plasmodium en dicha muestra como una indicación de la presencia de Plasmodium en dicha muestra.

Sondas de ïcido nucleico y mïtodos para detectar parïsitos de Plasmodium

ANTECEDENTES DE LA INVENCIïN

Plasmodium es un gïnero de protozoos parasitarios. La infecciïn con este gïnero se conoce como malaria. El parïsito siempre tiene dos hospedantes en su ciclo vital: un vector mosquito y un hospedante vertebrado. Al menos diez especies infectan humanos, incluyendo P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale. La malaria es una enfermedad infecciosa que estï extendida en las regiones tropicales y subtropicales. La malaria representa una amenaza a la supervivencia de hombres, mujeres y niïos. Infecta a entre 300 y 500 millones de personas cada aïo y provoca entre uno y tres millones de muertes al aïo, la mayorïa niïos pequeïos en el ïfrica Sub-Sahariana.

La malaria es una de las enfermedades infecciosas mïs comunes y supone un enorme problema de salud pïblica. La enfermedad estï causada por parïsitos protozoos del gïnero Plasmodium. Las formas mïs graves de la enfermedad estïn causadas por Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax, pero otras especies relacionadas (Plasmodium ovale y Plasmodium malariae) tambiïn pueden infectar a humanos. La determinaciïn de la especie infecciosa ayuda a determinar el curso de tratamiento para el paciente.

El diagnïstico preferido y mïs fiable de la malaria es el examen microscïpico de lïminas sanguïneas, ya que las cuatro especies parasitarias presentan caracterïsticas distintivas. Tradicionalmente se usan dos tipos de lïminas sanguïneas. Las lïminas finas son similares a las lïminas sanguïneas habituales y permiten la identificaciïn de especies debido a que la apariencia de los parïsitos se preserva mejor en esta preparaciïn. Las lïminas gruesas permiten al microscopista realizar un escrutinio de un volumen mayor de sangre y son aproximadamente once veces mïs sensibles que la lïmina fina, por lo que detectar niveles bajos de infecciïn es mïs sencillo con lïminas gruesas, pero la apariencia del parïsito se ve mucho mïs distorsionada y por tanto la distinciïn entre diferentes especies puede ser mucho mïs difïcil.

Con lïminas gruesas, un microscopista con experiencia puede detectar niveles de parïsito (o parasitemia) de hasta un 0, 0000001 % de cïlulas sanguïneas rojas. Sin embargo, el diagnïstico microscïpico puede ser difïcil debido a que los trofozoïtos precoces ("anillados") de las cuatro especies parecen idïnticos y nunca es posible diagnosticar especies en base a una ïnica forma anillada; la identificaciïn de especie se basa siempre en varios trofozoïtos.

En ïreas donde no se disponga de microscopio, existen tests de detecciïn de antïgenos que sïlo requieren una gota de sangre. OptiMAL-ITï (TCS Bio Sciences, Buckingham, Inglaterra) detectarï con fiabilidad falciparum hasta en un 0, 01 % de parasitemia y no falciparum hasta en un 0, 1 %. Paracheck-Pfï (Orchard Biomedical Systems, India) detectarï parasitemias de hasta un 0, 002 % pero no distinguirï entre malaria de falciparum y no falciparum. Tambiïn se pueden detectar ïcidos nucleicos usando reacciïn en cadena de polimerasa. Esta tïcnica es mïs precisa que la microscopïa. Sin embargo, es costosa y requiere un laboratorio especializado. Ademïs, los niveles de parasitemia no se correlacionan necesariamente con la progresiïn de la enfermedad, particularmente cuando el parïsito es capaz de adherirse a las paredes de los vasos sanguïneos. En algunos laboratorios clïnicos se dispone de mïtodos moleculares limitados y de ensayos rïpidos en tiempo real, por ejemplo, QT-NASBA (amplificaciïn basada en secuencias de ïcido nucleico cuantitativa en tiempo real, basada en reacciïn en cadena de polimerasa) pero todavïa se estïn desarrollando. Por tanto, es necesario desarrollar herramientas de diagnosis de tecnologïa sencilla para detectar niveles bajos de parasitemia en campo.

Lo que se necesita son reactivos y mïtodos para la detecciïn y discriminaciïn rïpida y precisa de diversas especies de Plasmodium causantes de malaria.

Se considera que la solicitud de patente de EE.UU. nï 5.792.609 representa la tïcnica anterior mïs prïxima.

SUMARIO DE LA INVENCIïN

Esta invenciïn se refiere a sondas de ïcido nucleico que detectan y discriminan entre diferentes especies de parïsitos de Plasmodium, por ejemplo, en ensayos de hibridaciïn. Por consiguiente, en un primer aspecto, la invenciïn se caracteriza por fragmentos de ïcido nucleico como los reivindicados en la Reivindicaciïn 2. Los fragmentos pueden usarse como sondas para detectar Plasmodium en un ensayo de hibridaciïn. La invenciïn tambiïn incluye sondas (ADN, ARN y PNA) que pueden discriminar entre P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale. En el contexto de la presente invenciïn, el tïrmino "discriminar entre" (o tïrminos similares) significa que la sonda se une a ïcido nucleico (p.ej., ARN, ADN, ARNr [ARN ribosomal] o ADNr [ADN ribosomal]) de una especie de forma mïs favorable que de las otras 3 especies.

En un segundo aspecto, la invenciïn se caracteriza por un mïtodo como el reivindicado en la reivindicaciïn 1 para detectar la presencia de Plasmodium en una muestra. En este mïtodo, se pone en contacto una muestra con un fragmento de ïcido nucleico en condiciones que permitan que el ïcido nucleico se hibride con un ïcido nucleico de Plasmodium. La detecciïn del fragmento de ïcido nucleico ligado al ïcido nucleico de Plasmodium de la muestra se usa como indicio de la presencia de Plasmodium en la muestra. La detecciïn con sondas de la presente invenciïn que discrimina entre las cuatro especies de Plasmodium enumeradas antes indica la presencia de dicha especie de Plasmodium.

En una realizaciïn de este aspecto de la invenciïn, el fragmento de ïcido nucleico contiene una secuencia seleccionada, preferiblemente, de entre al menos cinco, mïs preferiblemente al menos diez y lo mïs preferiblemente 5 al menos quince nucleïtidos consecutivos, o la secuencia entera de la sonda PGenus 1 o su secuencia complementaria de longitud completa.

En una segunda realizaciïn de este aspecto de la invenciïn, el fragmento de ïcido nucleico contiene una secuencia seleccionada, preferiblemente, de entre al menos cinco, mïs preferiblemente al menos diez o lo mïs preferiblemente al menos quince nucleïtidos consecutivos, o la secuencia entera de la sonda MalF1 o su secuencia complementaria de longitud completa.

En otra realizaciïn adicional de este aspecto de la invenciïn, el fragmento de ïcido nucleico contiene una secuencia seleccionada, preferiblemente, de entre al menos cinco, mïs preferiblemente al menos diez y lo mïs preferiblemente al menos quince nucleïtidos, o la secuencia entera de la sonda MalF2 o su secuencia complementaria de longitud completa.

En otra realizaciïn adicional de este aspecto de la invenciïn, el fragmento de ïcido nucleico contiene una secuencia seleccionada, preferiblemente, de entre al menos cinco, mïs preferiblemente al menos diez y lo mïs preferiblemente al menos quince nucleïtidos, o la secuencia entera de la sonda Mal1.8F o su secuencia complementaria de longitud completa.

En otra realizaciïn adicional de este aspecto de la invenciïn, el fragmento de ïcido nucleico contiene una secuencia seleccionada, preferiblemente, de entre al menos cinco, mïs preferiblemente al menos diez y lo mïs preferiblemente al menos quince nucleïtidos, o la secuencia entera de la sonda Mal1.8R, o su secuencia complementaria de longitud completa.

Una ventaja de las sondas PGenus 1, MalF1, MAIF2, Mal1.8F y Mal1.8R es que detectan las tres especies de Plasmodium evaluadas, y por tanto no se limitan a detectar una ïnica especie de Plasmodium. Otras caracterïsticas y ventajas de la presente invenciïn serïn evidentes a partir de la siguiente descripciïn detallada de la misma y tambiïn a partir de las reivindicaciones.

En aspectos especïficos, la presente invenciïn contempla un mïtodo para detectar la presencia de Plasmodium en una muestra, comprendiendo dicho mïtodo las etapas de: poner en contacto dicha muestra con una sonda para detectar Plasmodium en un ensayo de hibridaciïn, donde dicha sonda discrimina entre especies de Plasmodium, en condiciones que permitan a dicha sonda hibridarse con ïcido nucleico de Plasmodium; y detectar dicha sonda unida a dicho ïcido nucleico de Plasmodium en dicha muestra como una indicaciïn de la presencia de Plasmodium en dicha muestra.

En la realizaciïn precedente, el fragmento de ïcido nucleico comprende una secuencia que se selecciona de entre al menos cinco nucleïtidos consecutivos de sonda PV1, PV2, PF3, PF4, PF5, PM1 o PO1 o de su secuencia complementaria de longitud completa.

En otros aspectos, la presente invenciïn contempla un mïtodo... [Seguir leyendo]

1. Un mïtodo para detectar la presencia de Plasmodium en una muestra, comprendiendo dicho mïtodo las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra con una sonda de ïcido nucleico para detectar Plasmodium en un ensayo de hibridaciïn, donde dicha sonda discrimina entre especies de Plasmodium, en las condiciones que permitan que dicha sonda se hibride con ïcido nucleico de Plasmodium, donde dicha sonda se selecciona de un grupo que consiste en las sondas de SEQ ID NO.: 1 para detectar PGenus1, SEQ ID NO.: 3 para detectar MalF1, SEQ ID NO.: 4 para detectar MalF2, SEQ ID NO.: 5 para detectar Mal1.8F, SEQ ID NO.: 6 para detectar Mal1.8R, SEQ ID NO.: 7 para detectar PV1, SEQ ID NO.: 8 para detectar PV2, SEQ ID NO.: 10 para detectar PF2, SEQ ID NO.: 11 para detectar PF3, SEQ ID NO.: 12 para detectar PF4, SEQ ID NO.: 13 para detectar PF5, y SEQ ID NO.: 14 para detectar PM1 o sus secuencias complementarias; y

b) detectar dicha sonda unida a dicho ïcido nucleico de Plasmodium en dicha muestra como una indicaciïn de la presencia de Plasmodium en dicha muestra.

2. Un fragmento de ïcido nucleico que consiste en la secuencia completa seleccionada de una sonda seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13 y SEQ ID NO.: 14 o sus secuencias complementarias.

3. Un mïtodo para detectar y diferenciar entre P. falciparum, P. Vivax, P. malariae y P. ovale en una muestra, comprendiendo dicho mïtodo:

a) proporcionar: i) una muestra procedente de un sujeto que se sospecha que padece malaria y ii) sondas que comprenden ïcido nucleico adecuado para detectar y diferenciar entre P. falciparum, donde dicha sonda para detectar P. falciparum se selecciona entre; a) una secuencia de ïcido nucleico que consiste en uno o mïs de SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12 o SEQ ID NO.: 13 sus secuencias complementarias, P. Vivax, donde dicha sonda para detectar P. Vivax se selecciona entre: a) una secuencia de ïcido nucleico que consiste en uno o mïs de SEQ ID NO.: 7 o SEQ ID NO.: 8 o sus secuencias complementarias, P. malaria, donde dichas sondas para detectar P. malariae se seleccionan entre: a) una secuencia de ïcido nucleico que consiste en SEQ ID NO.: 14, o sus secuencias complementarias, y una o mïs de SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12 o SEQ ID NO.: 13, o sus secuencias complementarias, y donde una muestra es positiva para P. malariae si la sonda que tiene la SEQ ID NO.: 14 da positivo y la sonda correspondiente a SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12 o SEQ ID NO.: 13 da negativo y P. ovale, donde dichas sondas para detectar P. ovale se seleccionan entre: a) una secuencia de ïcido nucleico que consiste en SEQ ID NO.: 15, o sus secuencias complementarias, y una o mïs de SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12 o SEQ ID NO.: 13, o sus secuencias complementarias, y donde una muestra es positiva para P. ovale si la sonda con la SEQ ID NO.: 15 da positivo y la sonda con SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12 o SEQ ID NO.: 13 da negativo;

b) poner en contacto dicha muestra con dichas sondas en las condiciones adecuadas para la hibridaciïn de dichas sondas a las dianas; y

c) determinar la presencia de P. falciparum, P. Vivax, P. malariae y P. ovale, si existe, en la muestra.