Sistema de agitador.

Procedimiento de cultivo de células de mamífero, caracterizado porque las células de mamífero se cultivan en un dispositivo que comprende un sistema de agitador y un recipiente de cultivo,

en el que el sistema de agitador consiste en dos elementos de a gitador de transporte radial y un elemento de agitador de transporte axial dispuestos los unos sobre los otros en un árbol de agitador vertical,

en el que el elemento de agitador de transporte axial está dispuesto por encima de los elementos de agitador de transporte radial.

Sistema de agitador

En el presente documento se informa de un sistema de agitador para el cultivo de células animales que consiste en una combinación de al menos un elemento de transporte radial y al menos un elemento de transporte axial, en el que al menos tres elementos de transporte deben estar presentes y el elemento más alto es un elemento de transporte axial. Los elementos de transporte están dispuestos con una cierta separación los unos sobre los otros en un árbol. En una realización particular, el sistema de agitador consiste en dos agitadores de disco como elementos de transporte radial y un agitador de pala inclinada como elemento de transporte axial en el que el agitador de pala inclinada está dispuesto por encima del agitador de disco en el árbol. El agitador según la invención consigue, entre otras cosas, una mezcla más suave y mejor del medio de cultivo para el cultivo de células procariotas y eucariotas.

Antecedentes tecnológicos

La producción de proteínas recombinantes, vacunas y anticuerpos con la ayuda de células procariotas y eucariotas desempeña una función esencial en la producción farmacéutica moderna. Para producir proteínas y anticuerpos postraduccionalmente modificados complejos se usan principalmente células derivadas de animal. Sin embargo, el uso de células derivadas de animal plantea altas exigencias al proceso de fermentación debido a las características específicas de estas células tales como, por ejemplo, el medio de cultivo, la sensibilidad hacia la limitación e inhibiciones (por ejemplo, por lactato, C2, amonio etc.), la membrana externa sensible (tensión de cizallamiento), las bajas tasas específicas y la sensibilidad hacia variaciones en las condiciones de cultivo (por ejemplo, debido a faltas de homogeneidad locales, variaciones de pH, variaciones de p2, etc.). Estas propiedades tienen que tenerse en cuenta cuando se diseñan biorreactores y para el control de procesos.

En los últimos años se han desarrollado diversos tipos de reactores para cultivar células. Independientemente del tipo, el reactor debe poder cumplir las siguientes funciones técnicas básicas: suspensión adecuada, además de homogenización, transporte de material y de calor adecuado, además de una tensión de cizallamiento mínima sobre las células. El reactor de tanque con agitación es especialmente adecuado para uso industrial. En este reactor, la energía necesaria para cumplir las funciones básicas se introduce por agitación mecánica.

Se conoce de la bibliografía que las células de mamífero son mucho más sensibles a las fuerzas de cizallamiento que los microorganismos. Esto se atribuye normalmente a la ausencia de una pared celular (véase, por ejemplo, Glacken, M.W. y col., Trends Biotechnol. 1 (1983) 12-18; van der Pol, L.A. y Tramper, J. Enzyme Microb. Technol. 17 (1995) 41-47; Nienow, A.W., Cytotechnol. 5 (26) 9-33; Cervantes, M.l. y col., Chem. Eng. Sci. 61 (26) 875-884; Frahm, B. y col., Chem. Ing. Tech. 79 (27) 152-158). La sensibilidad al cizallamiento es el motivo de las considerables dificultades en la manipulación técnica de biorreactores de cultivo en suspensión. Los reactores de tanque con agitación se usan normalmente en procedimientos de producción de biotecnología para alimentar las células ya que éstos pueden ser más flexiblemente controlados y usados con respecto a las condiciones de procedimiento requeridas. Además de la geometría de los sistemas y la reología del material agitado, las funciones básicas anteriormente mencionadas se cumplen principalmente por los sistemas de agitadores que se usan.

Los motivos principales de la tensión de cizallamiento sobre las células que van cultivarse son, entre otros, las fuerzas de cizallamiento generadas por el sistema de agitador. Éstas tienen un intenso efecto, especialmente en la región de las palas de agitador, además de la de los tabiques deflectores. Según la teoría de Kolmogorov, los macro-vórtices generados por los agitadores se descomponen por disipación de energía para formar pequeños micro-vórtices. Cuando su tamaño se convierte en el mismo que el tamaño de las células que van a fermentarse, las células pueden dañarse (Cherry, R.S. y Papoutsakis, E.T., Biotechnol. Bioeng. 32 (1988) 11-114; Papoutsakls, E.T. y Kunas, K.T., en "Advances ¡n animal cell biology and technology for bioprocess", Spier, R.E. y col. (Eds) Butterworth, Sevenoaks, Kent, UK (1989) 23-211; Kunas, K.T. y Papoutsakis, E.T., Biotech. Bioeng. 36 (199) 476- 483; Zhang, Z.B. y Thomas, C.R., Gen. Eng. Biotechnol. 13 (1993) 19-29; Nienow, A.W., Cytotechnol. 5 (26) 9- 33).

Se han hecho recomendaciones del uso de agitadores en cultivos de células animales en suspensión (véase, por ejemplo, Feder, J. y Tolbert, W.R., Sel. Am. 248 (1983) 24-31; fabricantes de agitadores, por ejemplo, Ekato, Chemineer, Bloenglneerlng, Zeta) que enfatizan la generación de bajos flujos de cizallamiento como un criterio importante. Por tanto, se ha desarrollado un gran número de agitadores de baja fuerza de cizallamiento para reducir el daño (por ejemplo, "Impulsor de oreja de elefante" o "impulsor de flujo de Max").

En un artículo en línea ("Axial flow down-pumping agitators in biological processes", abril de 29, http://www.postmlxlng.com/mlxlng%2forum/Micro/Liq-Solid-Gas/down-pumpers.htm ) se muestra que una combinación de agitadores que consiste en diferentes agitadores produce una transferencia de masa mejorada. Con respecto a células animales se recomienda el uso de tres transportadores axiales para lograr los mejores resultados en el cultivo celular. Fujasova, M. y col., (Chem. Eng. Sci. 62 (27) 165-1669) informan de correlaciones en la transferencia de masa para agitadores de múltiples etapas. La transferencia de masa entre la fase gaseosa y la fase

líquida usando un sistema de agitador de tres etapas en un biorreactor se informa por Puthli y col. (Puthli, M.S. y col., Biochem. Eng. J. 23 (25) 25-3).

El uso de un termentador para cultivar células bacterianas con un árbol giratorio vertical al que están unidos preferentemente dos o tres agitadores Rushton se informa en el documento US 5.633.165. Nlenow, A.W., (Cytotechnol. 5 (26) 9-33) recomienda un sistema de reactor para el cultivo de células animales con una relación H/D de 1 a 1,3 y el uso de dos agitadores de hidroplaneador de transporte hacia abajo (transportadores axiales) con un alreador que está montado debajo del agitador más bajo.

En el documento US 24/234435 se informa de un aparato y procedimiento de producción de ácidos carboxfllcos aromáticos. Se informa de un reactor de polimerización continuo en el documento US 4.438.74. En el documento US 24/87814 se informa de un sistema de agitación para reactores de oxidación de alquilbenceno. Un sistema de mezcla se informa en el documento US 5.972.661. En el documento US 6.25.769 se informa de un aparato de agitación con mezcladora estática o medios generadores de turbulencia. Los agitadores se Informan en el documento US 5.198.156. En el documento US 4.779.99 se Informa de un aparato impulsor.

Resumen de la invención

En el presente documento se Informa de un sistema de agitador que comprende al menos un elemento de transporte radial y al menos un elemento de transporte axial en el que al menos tres elementos de transporte deben estar presentes y el elemento más alto de transporte es un elemento de transporte axial. En comparación con los agitadores que normalmente se usan para cultivar células animales sensibles al cizallamlento, el sistema de agitador que se informa en el presente documento puede conseguir una mezcla más rápida del medio de cultivo (por ejemplo, con el fin de introducir agentes correctores tales como ácidos o bases mediante la superficie del líquido) sin exponer las células en el medio de cultivo a alta tensión de cizallamiento.

En una realización, el sistema de agitador consiste en 3 a 5 elementos de transporte. En otra realización, el sistema de agitador consiste en 3 ó 4 elementos de transporte. En otra realización, los elementos de transporte del sistema de agitador están dispuestos a una cierta distancia los unos encima de los otros en un árbol vertical. En otra realización más, los elementos de transporte están dispuestos en el árbol con la misma distancia entre sí. En otra realización más, la distancia entre los elementos de transporte es entre uno y dos diámetros del elemento de transporte d. En una realización, los elementos de transporte del sistema de agitador están dispuestos en un árbol vertical por lo que el elemento más alto de transporte está a una distancia definida del elemento de transporte inferior y está a una distancia suficiente de la superficie del líquido del medio de cultivo cuando el sistema de agitador opera... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de cultivo de células de mamífero, caracterizado porque las células de mamífero se cultivan en un dispositivo que comprende un sistema de agitador y un recipiente de cultivo,

en el que el sistema de agitador consiste en dos elementos de agitador de transporte radial y un elemento de agitador de transporte axial dispuestos los unos sobre los otros en un árbol de agitador vertical, en el que el elemento de agitador de transporte axial está dispuesto por encima de los elementos de agitador de transporte radial.

2. Procedimiento de producción de un polipéptido que comprende las siguientes etapas:

a) cultivar una célula de mamífero que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido en un dispositivo que comprende un sistema de agitador y un recipiente de cultivo,

en el que el sistema de agitador consiste en dos elementos de agitador de transporte radial y un elemento de

agitador de transporte axial dispuestos los unos sobre los otros en un árbol de agitador vertical,

en el que el elemento de agitador de transporte axial está dispuesto por encima de los elementos de agitador de

transporte radial,

b) recuperar el polipéptido del medio de cultivo o de las células,

c) purificar el polipéptido y así producir el polipéptido.

3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el sistema de agitador tiene, cuando se usa en el recipiente de cultivo que comprende un medio de cultivo, un número de Newton de 5,5 a 8, a un número de Reynolds de 5*14 a 5*15.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el sistema de agitador tiene, cuando se usa en el recipiente de cultivo que comprende un medio de cultivo, un tiempo de mezcla o,95 de aproximadamente 2 segundos a una entrada de potencia de aproximadamente ,5 W/kg y de aproximadamente 1 segundos a una entrada de potencia de aproximadamente ,3 W/kg.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el sistema de agitador consiste en dos agitadores de disco o dos turbinas Rushton como elementos de agitador de transporte radial y un agitador de pala inclinada como elemento de agitador de transporte axial.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los elementos de agitador de transporte radial tienen entre 2 y 8 palas de agitador y el elemento de agitador de transporte axial tiene entre 2 y 1 palas de agitador.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque todos los elementos de transporte tienen el mismo diámetro d.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la relación del diámetro d de los elementos de agitación con respecto al diámetro D del recipiente de cultivo está en el intervalo de ,32 a ,35.

9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el paso de las palas de agitador del elemento de agitador de transporte axial está entre 1° y 8° con respecto al árbol de agitador.

1. Uso de un sistema de agitador que consiste en dos elementos de agitador de transporte radial y un elemento de agitador de transporte axial dispuestos los unos sobre los otros en un árbol de agitador vertical, en el que el elemento de agitador de transporte axial está dispuesto por encima de los elementos de agitador de transporte radial para la mezcla del medio de cultivo de células de mamífero.

11. Dispositivo de cultivo de células animales, caracterizado porque el dispositivo comprende:

a) un recipiente de cultivo,

b) un árbol vertical a lo largo del eje central del recipiente de cultivo,

c) un sistema de agitador que consiste en dos elementos de agitador de transporte radial y un elemento de agitador de transporte axial dispuestos los unos sobre los otros en un árbol de agitador vertical, en el que el elemento de agitador de transporte axial está dispuesto por encima de los elementos de agitador de transporte radial,

d) una alimentación de gas en la parte inferior del recipiente de cultivo, y

e) al menos una entrada en el área por encima de la superficie del líquido para añadir disoluciones correctoras y/o de alimentación.

12. El uso según la reivindicación 1 o el dispositivo según la reivindicación 11, caracterizado porque el sistema de agitador tiene, cuando se usa en un recipiente de cultivo que comprende un medio de cultivo, un número de Newton de 5,5 a 8, a un número de Reynolds de 5*14 a 5*15

13. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 12 o el dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado porque el sistema de agitador tiene, cuando se usa en un recipiente de cultivo que comprende un medio de cultivo, un tiempo de mezcla o,95 de aproximadamente 2 segundos a una entrada de potencia de aproximadamente ,5 W/kg y de aproximadamente 1 segundos a una entrada de potencia de aproximadamente ,3 W/kg.

14. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1y12a13oel dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque el sistema de agitador consiste en dos agitadores de disco o dos turbinas Rushton como elementos de agitador de transporte radial y un agitador de pala inclinada como elemento de agitador de transporte axial.

15. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 12 a 14 o el dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque los elementos de agitador de transporte radial tienen entre 2 y 8 palas de agitador y el elemento de agitador de transporte axial tiene entre 2 y 1 palas de agitador.

16. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1y12a 15o el dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque todos los elementos de transporte tienen el mismo diámetro d.

17. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 12 a 16 o el dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque la relación del diámetro d de los elementos de agitación con respecto al diámetro D del recipiente de cultivo está en el intervalo de ,32 a ,35.

18. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1y12a17oel dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, caracterizado porque el paso de las palas de agitador del elemento de agitador de transporte axial está entre 1° y 8° con respecto al árbol de agitador.