Selección de marco.

Un método para obtener al menos un anticuerpo humanizado con especificidad para un antígeno seleccionado que comprende:

(a) proporcionar secuencias de región VH y/o VL de anticuerpos donantes múltiples, cada una con especificidad para el antígeno seleccionado;

(b) seleccionar una secuencia marco aceptora de la región VH y/o VL humana apropiada para cada secuencia donante, en donde la selección comprende realizar una alineación de homologías entre la secuencia VH donante y las secuencias aceptoras de la región VH humanas, y/o la secuencia VL donante y las secuencias aceptoras de la región VL humana, y seleccionar aquellas secuencias aceptoras humanas que:

(I) para VH:

(i) comparten identidad con la secuencia donante de al menos cinco residuos seleccionados de un grupo de seis residuos constituidos por residuos 24, 49, 71, 73, 78 y 93, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat; y

(ii) comparten identidad con la secuencia donante de al menos veintidós residuos seleccionados del grupo constituido por 1, 2, 3, 4, 6, 7, 11, 23, 25, 36, 37, 38, 39, 41, 44, 45, 46, 47, 48, 67, 69, 76, 87, 89, 91 y 94, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat;

y/o

(II) para VL (Kappa):

(i) comparten identidad con la secuencia donante de al menos dos residuos seleccionados del grupo constituido por 46, 48 y 58, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat; y

(ii) comparten identidad con la secuencia donante en al menos veintiún residuos seleccionados del grupo constituido por 1, 2, 3, 4, 6, 35, 36, 37, 38, 44, 45, 47, 49, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 85 y 87, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat;

(c) transferir CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de cada anticuerpo donante a cada una de las secuencias marco aceptoras humanas apropiadas seleccionadas para obtener un panel de secuencias de anticuerpos humanizados, en donde únicamente las CDRs de cada anticuerpo donante se transfieren a cada una de las secuencias marco aceptoras humanas apropiadas seleccionadas y el panel de secuencias de anticuerpos humanizados tienen todas ellas especificidad para el mismo antígeno seleccionado;

(d) expresar las secuencias de anticuerpos humanizados en donde únicamente las CDRs de cada anticuerpo donante han sido transferidas;

(e) cribar las secuencias expresadas respecto a actividad de fijación de antígeno; y

(f) seleccionar al menos un anticuerpo humanizado de afinidad alta.

** (Ver fórmula) **

** (Ver fórmula) **

** (Ver fórmula) **

** (Ver fórmula) **

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E07733392

Más preferiblemente, el número de residuos en el Nivel 2L con identidad compartida en el paso (xii) anterior, para la región VL es veintidós o veintitrés residuos, aún más preferiblemente veinticuatro o veinticinco residuos, y muy preferiblemente la totalidad de los veintiséis residuos comparten identidad.

En un ejemplo específico, puede asignarse un peso diferente a los residuos del Nivel 2L del paso (xii) anterior, dividiendo así el Nivel 2L en dos; Nivel 2Lâ? y Nivel 3L (véase Tabla 1) . Así, donde marcos VL apropiados múltiples son evidentes, es decir dos o más secuencias tienen el mismo número de identidades, se asigna peso a un segundo subconjunto de residuos (Nivel 2Lâ?) . De acuerdo con ello, la selección de una secuencia marco aceptora VL humana apropiada puede comprender además:

(xiii) evaluar la homología entre la secuencia donante VL y dos o más secuencias humanas seleccionadas 10 en el paso (x) anterior; y (xiv) seleccionar aquellas secuencias humanas que comparten identidad con la secuencia donante en al menos quince residuos seleccionados del grupo constituido por 2, 6, 35, 36, 38, 44, 49, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 71, 85 y 87, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Más preferiblemente, el número de residuos con identidad compartida en el paso (xiv) anterior, para la región VL es 15 dieciséis o diecisiete residuos. Muy preferiblemente, la totalidad de los dieciocho comparten identidad.

Donde marcos VL apropiados múltiples son de nuevo evidentes, es decir que tienen el mismo número de identidades, se asigna peso a un tercer subconjunto de residuos. De acuerdo con ello, el método puede comprender además:

(xv) evaluar la homología entre la secuencia donante VL y dos o más secuencias humanas seleccionadas 20 en el paso (xiv) anterior; y (xvi) seleccionar aquellas secuencias humanas que comparten identidad con la secuencia donante en al menos seis residuos seleccionados del grupo constituido por 1, 3, 4, 37, 45, 47, 60 y 70, numerados de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Preferiblemente, el número de residuos con identidad compartida en el paso (xvi) anterior, para la secuencia VL es al 25 menos siete. Muy preferiblemente, la totalidad de los ocho residuos comparten identidad.

Tabla 1. Residuos de Nivel

Nivel Residuo de Nivel; numerado de acuerdo con Kabat

1H 24, 49, 71, 73, 78, 93

2H 1, 2, 3, 4, 6, 7, 11, 23, 25, 36, 37, 38, 39, 41, 44, 45, 46, 47, 48, 67, 69, 76, 87, 89, 91, 94

2H' 36, 37, 39, 45, 47, 48, 76, 89, 91, 94

3H 1, 2, 3, 4, 6, 7, 11, 23, 25, 38, 41, 44, 46, 67, 69, 87

1L 46, 48, 58

2L 1, 2, 3, 4, 6, 35, 36, 37, 38, 44, 45, 47, 49, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 85, 87

2L' 2, 6, 35, 36, 38, 44, 49, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 71, 85, 87

3L 1, 3, 4, 37, 45, 47, 60, 70

H = cadena pesada; L = cadena ligera En una realización muy preferida, las alineaciones y los apareamientos se realizan en un solo paso, preferiblemente de una manera automática. Puede utilizarse un BLAST estándar como se conoce en la técnica. Así, puede utilizarse un programa de computadora para identificar los residuos compartidos dentro de los Niveles 1 a 3 anteriores, asignando el peso máximo a los residuos de Nivel 1 y el peso mínimo a los residuos de Nivel 2. Así pues, los métodos de la invención pueden realizarse de forma manual, consecutiva o secuencial, y muy preferiblemente, de manera automática (v.g. utilizando una computadora) , consecutiva o secuencialmente.

** (Ver fórmula) **

** (Ver fórmula) **