Reducción del contenido de dímeros en composiciones de polipéptidos del factor VII por tratamiento térmico.

Un método para reducir el contenido de dímeros en una composición que contiene un polipéptido del factor VII,

que comprende los pasos de:

(a) si fuera necesario, ajustar el pH de dicha composición a un valor en el intervalo de 5.0-10.0 (según lo determinado a 5 °C);

(b) calentar la composición hasta una temperatura en el intervalo de 20 a 50 °C durante un período de al menos 5 minutos; y

(c) posteriormente enfriar la composición hasta una temperatura a lo sumo de 10 °C.

Reducción del contenido de dímeros en composiciones de polipéptidos del factor VII por tratamiento térmico CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para reducir el contenido de dímeros en composiciones de polipéptidos del factor VII, en particular composiciones que contienen variantes del factor VII.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se ha demostrad que el factor VII, que está implicado en la cascada de coagulación, es un agente terapéutico útil para tratar diversas afecciones patológicas. En consecuencia, hay una creciente necesidad de formulaciones que contengan los polipéptidos del factor VII activados que sean farmacéuticamente aceptables y tengan una eficacia clínica uniforme y predeterminada.

Durante la fabricación comercial de polipéptidos del factor VII, evitar la formación de agregados como di -y oligómeros del polipéptido de interés es un desafío. Dichas impurezas relacionadas con el producto son indeseadas debido a su potencial antigenicidad. Normalmente, se evitan los pH extremos y las altas temperaturas para controlar la formación de agregados/dímeros durante la producción.

WO 2007/026020 A1 se refiere a un método para purificar una composición que contiene polipéptidos del factor VII y el factor VIIa de los subproductos de la fabricación, mientras se reduce al mínimo la formación concurrente de productos de autodegradación del factor VII o el factor VIIa.

Por lo tanto, en relación con la fabricación de polipéptidos del factor VII, existe la necesidad de un paso de producción en el que la presencia de dímeros (incluidos los oligómeros superiores) del polipéptido del factor VII se reduzca sin pérdida significativa del rendimiento. Esto resultará en una sustancia farmacológica más segura y más estable, y finalmente un producto farmacéutico más seguro y más estable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención ha solucionado el problema mencionado antes mediante la aplicación de un paso de tratamiento térmico para reducir el contenido de dímeros (y oligómeros superiores) .

Específicamente, la presente invención proporciona un método para reducir el contenido de dímeros en una composición que contiene un polipéptido del factor VII, que comprende los pasos de:

(a) si fuera necesario, ajustar el pH de dicha composición a un valor en el intervalo de 4.5-10.0 (según lo 40 determinado a 5 º C) ;

(b) calentar la composición hasta una temperatura en el intervalo de 20 a 50 º C durante un período de al menos 5 minutos; y 45 (c) posteriormente enfriar la composición hasta una temperatura a lo sumo de 10 º C.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 ilustra el desarrollo del contenido de dímeros en una muestra de la composición 50 V158D/E296V/M298Q-FVII tratada con calor a 37 º C durante 120 minutos. Escala: tiempo en minutos.

La figura 2 ilustra el desarrollo del contenido de dímeros en tres muestras por lo demás idénticas de la composición V158D/E296V/M298Q-FVII que se calientan a 23 º C o a 37 º C, o se almacenan a 5-8 º C (control) , durante 48 horas. Escala: tiempo en horas.

La figura 3 ilustra la cantidad de HMWP (polímero y oligómero) , monómero y sal que queda después de completar la invención descrita.

La figura 4 ilustra el desarrollo del contenido de dímero en una muestra de la composición 60 V158D/E296V/M298Q-FVII en la que el pH se ajustó a 9.5 antes del tratamiento térmico a 37 º C durante 168 horas. Escala: tiempo en horas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Como se mencionó antes, la presente invención se refiere a un método para reducir el contenido de dímeros en una composición que contiene un polipéptido del factor VII. El método se aplica ventajosamente en la etapa final del proceso global para la producción de un polipéptido del factor VII, en que la manipulación posterior de la composición, que incluye calentamiento, cambios en el pH, poner en contacto con materiales cromatográficos, etc. puede causar una nueva formación de dímeros.

El método comprende los pasos siguientes de los cuales el paso (a) no es obligatorio:

(a) si fuera necesario, ajustar el pH de dicha composición a un valor en el intervalo de 4.5-10.0 (según lo determinado a 5 º C) ;

(b) calentar la composición hasta una temperatura en el intervalo de 20 a 50 º C durante un período de al menos 5 minutos; y

(c) posteriormente enfriar la composición hasta una temperatura a lo sumo de 10 º C.

Composición que contiene un polipéptido del factor VII

Cuando se utiliza en este documento, la expresión "composición" tiene la intención de dar a entender una composición líquida, preferentemente una composición líquida acuosa, es decir una composición que contenga menos de 5% de solventes no acuosos. La composición para ser utilizada en el método contiene el polipéptido del factor VII así como ciertas impurezas en forma de dímeros.

El término "dímero" tiene la intención de incluir dímeros verdaderos así como oligómeros superiores y agregados (por ej. trímeros, tetrámeros, etc.) de cualquier polipéptido del factor VII. Se ha observado que algunas variantes polipeptídicas del factor VII tienen una mayor tendencia a formar dímeros, en comparación con el factor VII de tipo silvestre. La mayor formación de dímeros se puede explicar por el hecho de que las variantes polipeptídicas del factor VII tienen estructuras diferentes que el factor VII de tipo silvestre y, en consecuencia, propiedades diferentes. Un ejemplo de una propiedad diferente es la temperatura a la cual se despliegan, es decir, su punto de fusión. Cuando los polipéptidos del factor VII se despliegan, su superficie se vuelve más hidrófoba y por lo tanto pueden tender a interaccionar con otros polipéptidos desplegados hidrófobos del factor VII, formando por ese motivo dímeros. Por esta razón, la invención se puede considerar particularmente, aunque no exclusivamente, aplicable a las composiciones de dichas variantes polipeptídicas del factor VII.

El método de la invención es particularmente útil para composiciones con un contenido relativamente elevado de dímeros, es decir, el contenido de dímeros en la composición sin tratar (es decir, antes del paso (b) ) es de al menos 3%, por ej. de al menos 4%, por ej. de al menos 5%, por ej. de al menos 6%, por ej. de al menos 8%, o incluso de al menos 10%.

La expresión " polipéptido del factor VII" se describe en más detalle más adelante. Basándose en las observaciones preliminares, se cree que la presente invención es especialmente adecuada para las formas no nativas del factor VII, como las variantes del factor VII, porque los polipéptidos de este grupo parecen tener una mayor tendencia a formar dímeros. Por lo tanto, en una realización, el polipéptido del factor VII utilizado en el método según la presente invención es un factor VIIa humano de tipo no silvestre, por ej. una variante del factor VII.

La concentración del factor VIIa en la composición se expresa convenientemente como mg/mL o como UI/mL, donde 1 mg representa generalmente 43 000-56 000 UI o más. La concentración del polipéptido del factor VII en la composición es habitualmente al menos de 0.01 mg/mL, o al menos de 0.1 mg/mL. En diferentes realizaciones, el polipéptido del factor VII está presente en la composición en una concentración de 0.1-90 mg/mL; 0.5-80 mg/mL; 1.0-80 mg/mL; 1.5-70 mg/mL; 2-60 mg/mL; 3-50 mg/mL; o 5-50 mg/mL.

La composición puede, antes del paso (a) , y en particular con posterioridad a cualquier aplicación del paso (a) , incluir un tampón (debe ser entendido como un único agente o una combinación de agentes) que sea capaz de mantener el pH dentro del intervalo especificado, es decir, dentro de 4.5-10.0.

En una realización, el tampón es al menos un componente elegido de los grupos constituidos por los ácidos y las sales de MES, PIPES, ACES, BES, TES, HEPES, TRIS, histidina, imidazol, glicina, glicilglicina, glicinamida, ácido fosfórico, ácido acético (por ejemplo acetato de sodio o calcio) , ácido láctico, ácido glutárico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido maleico y ácido succínico. Se debe entender que el tampón puede consistir en una mezcla de dos o más componentes, donde la mezcla sea capaz de proporcionar un valor de pH en el intervalo especificado. Como ejemplos se pueden mencionar el ácido acético y el acetato de sodio, etc.

La concentración del tampón se elige de modo de mantener el pH preferido de la composición. En varias realizaciones, la concentración del tampón es de 1-100 mM; 1-50 mM; 1-25 mM; o 2-20 mM.

Se ha observado... [Seguir leyendo]

1. Un método para reducir el contenido de dímeros en una composición que contiene un polipéptido del factor VII, que comprende los pasos de: 5

(a) si fuera necesario, ajustar el pH de dicha composición a un valor en el intervalo de 5.0-10.0 (según lo determinado a 5 º C) ;

(b) calentar la composición hasta una temperatura en el intervalo de 20 a 50 º C durante un período de al 10 menos 5 minutos; y (c) posteriormente enfriar la composición hasta una temperatura a lo sumo de 10 º C.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la temperatura del paso (b) está en el intervalo d.

3. 45 15 º C y el período de calentamiento del paso (b) en el intervalo de 10-600 minutos.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el pH se ajusta a un valor de 5.0-6.5 en el paso (a) .

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el polipéptido del factor VII es una variante del factor VII.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición contiene una sal de calcio. 25

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el nivel de dímeros en dicha composición expresado como puntos porcentuales con respecto al agrupamiento total de polipéptidos del factor VII, se redujo en al menos un factor de 2.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el polipéptido del factor VII es activado en un paso posterior al paso (b) .

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que un paso de cromatografía de intercambio aniónico precede al paso (a) . 35