Purificación y estabilización de péptidos y proteínas en agentes farmacéuticos.

Una formulación en polvo seco para su uso en medicina que comprende micropartículas de dicetopiperazina recubiertas con un principio activo,

en la que el principio activo es un péptido o una proteína terapéuticos, profilácticos o diagnósticos, y en la que el recubrimiento se forma recubriendo el principio activo con micropartículas preformadas de dicetopiperazina.

Purificación y estabilización de péptidos y proteínas en agentes farmacéuticos Antecedentes de la invención

La presente invención está en general en el campo de las formulaciones farmacéuticas, y se refiere más particularmente a métodos y composiciones para purificar y estabilizar péptidos y proteínas, tales como insulina, que se usan en aplicaciones farmacéuticas.

En una persona normal, las células p de los islotes pancreáticos de Langerhans producen insulina, necesitada por el cuerpo para el metabolismo de la glucosa, en respuesta a un aumento de la concentración de glucosa en la sangre. La insulina metaboliza la glucosa entrante y detiene temporalmente la transformación por el hígado de glucógeno y lípidos a glucosa permitiendo de ese modo al cuerpo mantener la actividad metabólica entre comidas. El diabético Tipo I, sin embargo, tiene una capacidad reducida o total incapacidad para producir insulina debido a la destrucción de células p y necesita reemplazar la insulina por medio de inyecciones diarias o una bomba de insulina. Pero, más común que la diabetes Tipo I, es la diabetes Tipo II, que se caracteriza por resistencia a la insulina y función pancreática crecientemente dañada de las células p. Los diabéticos Tipo II pueden todavía producir insulina, pero también pueden necesitar terapia de sustitución de insulina.

Los diabéticos de Tipo II normalmente presentan una respuesta retardada a incrementos en los niveles de glucosa en sangre. Mientras que las personas normales generalmente liberan insulina en 2-3 minutos tras el consumo de alimentos, los diabéticos de Tipo II pueden no segregar insulina endógena durante varias horas tras el consumo. Como resultado, la producción de glucosa endógena continúa tras el consumo (Pfeiffer, Am. J. Med, 70:579-88 (1981)), y el paciente experimenta hiperglucemia debido a niveles elevados de glucosa en sangre.

La pérdida de secreción de insulina provocada por glucosa es una de las alteraciones más tempranas de la función de las células p (Cerasi et al., Diabetes, 21:224-34 (1972); Polonsky et al., N. Engl. J. Med, 318:1231-39 (1988)), pero las causas y el grado de disfunción de las células p se desconocen en la mayoría de los casos. Mientras que los factores genéticos juegan un papel importante, (Leahy, Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes, 2:300-06 (1995)), algunas alteraciones de la secreción de insulina parecen ser adquiridas y pueden ser reversibles al menos parcialmente mediante un control óptimo de la glucosa. El control óptimo de la glucosa por medio de la terapia de insulina tras una comida puede llevar a una significativa mejora de la liberación natural de insulina provocada por glucosa requiriendo tanto una respuesta normal del tejido a la insulina administrada como un aumento brusco en las concentraciones de insulina en suero. Por lo tanto, el desafío presentado en el tratamiento de los diabéticos de Tipo II en estado temprano, aquéllos que no tienen pérdida excesiva de función de las células p, es restaurar la liberación de insulina después de las comidas.

La mayoría de los diabéticos Tipo II de fase temprana se tratan con agentes orales, pero con poco éxito. Las inyecciones subcutáneas de insulina también raramente son eficaces para proporcionar insulina a los diabéticos Tipo II y, de hecho, pueden empeorar la acción de la insulina debido a un comienzo de acción retrasado, variable, y superficial. Se ha demostrado, sin embargo, que si se administra insulina por vía intravenosa con una comida, los diabéticos Tipo II de estado temprano experimentan la interrupción de la glucogénesis hepática y presentan un control fisiológico aumentado de la glucosa. Además, sus niveles de ácidos grasos libres se reducen a un ritmo mayor que sin la terapia de insulina. Aunque posiblemente sea útil para tratar la diabetes de Tipo II, la administración por vía intravenosa de insulina no es una solución razonable, ya que no es seguro o factible que los pacientes se administren insulina por vía intravenosa con cada comida.

La insulina, un polipéptido con un peso molecular nominal de 6,000 Dalton, se ha producido tradicionalmente procesando páncreas de cerdo y vaca para aislar el producto natural. Más recientemente, sin embargo, se ha usado tecnología recombinante para producir insulina humana in vitro. La insulina humana natural y recombinante en solución acuosa está en una configuración hexamérica, esto es, seis moléculas de insulina recombinante se asocian de manera no covalente en un complejo hexamérico cuando se disuelve en agua en presencia de iones de cinc. La insulina hexamérica no se absorbe rápidamente. Para que la insulina humana se absorba dentro de la circulación del paciente, la forma hexamérica debe primero asociarse en formas diméricas y/o monoméricas antes de que la sustancia pueda moverse dentro del torrente sanguíneo. El retraso en la absorción requiere que la insulina humana recombinante se administre aproximadamente media hora antes de la hora de la comida con el fin de producir el nivel terapéutico de insulina en sangre, lo que puede ser laborioso para los pacientes, que tienen que anticipar con precisión las horas a las que comerán. Para superar este retraso, se han desarrollado análogos de la insulina recombinante humana, tales como HUMALOG, que se disocian rápidamente en una forma virtualmente monomérica totalmente tras administración subcutánea. Los estudios clínicos han demostrado que HUMALOG se absorbe cuantitativamente más rápido que la insulina humana recombinante tras administración subcutánea. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N2 5.547.929 de Anderson Jr., et al.

En un esfuerzo de evitar las desventajas asociadas con la administración por inyección y para acelerar la absorción, se ha desarrollado la administración de análogos monoméricos de insulina por vía pulmonar. Por ejemplo, la Patente

de los Estados Unidos N2 5.888.477 de Gonda, et al. divulga hacer que un paciente inhale una formulación de insulina monomérica en aerosol para depositar partículas de insulina en el tejido pulmonar del paciente. Sin embargo, la formulación monomérica es inestable y pierde actividad rápidamente, mientras que la velocidad de captación permanece inalterada.

Aunque sería deseable producir insulina rápidamente absorbible derivada de fuentes naturales, la transformación de la forma hexamérica en la forma monomérica, tal como mediante la eliminación del cinc del complejo, produce una insulina que es inestable y tiene una vida útil indeseablemente corta. Por lo tanto, sería deseable proporcionar formar monoméricas de insulina a la vez que se mantiene su estabilidad en ausencia de cinc. También sería ventajoso proporcionar a los pacientes diabéticos composiciones de insulina monomérica que sean adecuadas para la administración pulmonar, proporcionen rápida absorción, y que puedan producirse en formulaciones listas para usar que tengan una vida útil comercialmente viable.

Estos problemas con impurezas, iones metálicos que afectan a la estabilidad o biodisponibilidad, suceden con muchas otras proteínas y péptidos.

La Patente de los Estados Unidos N2 6.071.497 de Steiner, et al., divulga sistemas de administración de fármacos en micropartículas en los que el fármaco se encapsula en micropartículas de dicetopiperazina que son estables a un pH de 6,4 o menos e inestables a pH de más de 6,4, o que son estables a un pH tanto ácido como básico, pero que son inestables a un pH de entre aproximadamente 6,4 y 8. La patente no describe composiciones de insulina monomérica que sean adecuadas para administración pulmonar, que proporcionen rápida absorción, y que puedan producirse en formulaciones listas para usar que tengan una vida útil comercialmente viable.

Sería por tanto ventajoso desarrollar composiciones alternativas de administración de insulina para diabéticos Tipo II que proporcionen elevación más rápida de los niveles de insulina en sangre y que administren con facilidad para asegurar el cumplimiento por parte del paciente. También sería deseable aplicar las composiciones y métodos de administración a otros agentes biológicamente activos.

La presente solicitud describe métodos mejorados para purificar péptidos y proteínas, especialmente en la preparación de composiciones adecuadas para administración pulmonar.

La presente solicitud describe composiciones estables de péptidos monoméricos adecuadas para administración pulmonar.

La presente solicitud describe métodos y composiciones para el transporte facilitado de insulina y otros agentes biológicamente activos a través de membranas biológicas.

La presente solicitud describe métodos y composiciones para la absorción... [Seguir leyendo]

1. Una formulación en polvo seco para su uso en medicina que comprende micropartículas de dicetopiperazina recubiertas con un principio activo, en la que el principio activo es un péptido o una proteína terapéuticos, profilácticos o diagnósticos, y en la que el recubrimiento se forma recubriendo el principio activo con micropartículas preformadas de dicetopiperazina.

2. La formulación en polvo seco de la reivindicación 1, para su uso en medicina mediante administración a un sujeto con un inhalador de polvo seco.

3. La formulación en polvo seco de las reivindicaciones 1 o 2, para su uso en medicina mediante administración a un sujeto por inhalación.

4. La formulación en polvo seco de cualquier reivindicación anterior, para su uso en medicina mediante dispensación pulmonar a un sujeto.

5. La formulación en polvo seco para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que el principio activo es un agente vasoactivo, un agente neuroactivo, una hormona, un anticoagulante, un agente inmunomodulador, un agente citotóxico, un antibiótico, un antiviral, un antígeno o un anticuerpo.

6. La formulación en polvo seco para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína o el péptido terapéuticos, profilácticos o diagnósticos son una hormona, una citocina u otro péptido inmunomodulador, un antígeno o una vacuna.

7. La formulación en polvo seco para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que el principio activo es insulina humana natural o recombinante.

8. La formulación en polvo seco para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que el principio activo es una forma estabilizada de insulina que se ha purificado para eliminar el cinc.

9. La formulación en polvo seco para su uso según cualquier reivindicación anterior, en la que el recubrimiento se forma mediante un método que comprende proporcionar una suspensión de micropartículas de dicetopiperazina, añadir una solución de principio activo que es insulina en una forma hexamérica, retirar iones de cinc lavando con un disolvente, y después liofilizar o criodesecar para dar las micropartículas de dicetopiperazina recubiertas.

10. La formulación en polvo seco para el uso de la reivindicación 1, en la que las micropartículas comprenden del 0,1 % al 50 % en peso del péptido o de la proteína terapéuticoss, profilácticos o diagnósticos.

11. La formulación en polvo seco para el uso de cualquier reivindicación anterior, en la que la dicetopiperazina es dicetopiperazina de fumarilo.

12. Un inhalador de polvo seco que comprende una formulación en polvo seco como se define en cualquier reivindicación anterior.

13. El inhalador de polvo seco de la reivindicación 12 para su uso en medicina, mediante dispensación de la formulación en polvo seco a un sujeto por inhalación.