Purificación de conjugados utilizando hidroxipatita.

Un método para purificar conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos a partir de una mezcla que incluye proteína de portador libre y conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos,

y también podría incluir proteínas contaminantes, que incluye:

el contacto de dicha mezcla con hidroxiapatita de forma que la proteína portadora se una a la hidroxiapatita mientras los conjugados no se unen;

y la recolección de los conjugados libres de proteínas de sacáridos portadores de antígenos; donde el antígeno sacárido es un sacárido capsular bacteriano.

ÁMBITO TÉCNICO

[1] Este invento pertenece al ámbito de las vacunas y está relacionado con un nuevo método para la purificación de conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos.

CONTEXTO DE LA TÉCNICA

[2] En los últimos 2 años, se han desarrollado vacunas conjugadas, que comprenden polisacáridos capsulares bacterianos conjugados con portadores proteicos. Entre los ejemplos se incluye la vacuna conjugada [1] Haemophilus influenzae tipo b (Hib) [1], así como las vacunas conjugadas contra el Streptococcus pneumoniae [2] y el serogrupo C Neisseña meningitidis (MenC) [3], WO 26/11381 se refiere a un compuesto conjugado multivalente de neumococo oolisacárido-proteico.

[3] Las proteínas portadoras que se utilizan en las vacunas autorizadas incluyen el tétanos toxoide (TT), la difteria toxoide (DT), el mutante CRM197 no tóxico de la toxina de la difteria, y el complejo de la proteína de la membrana externa del grupo B de N.meningitidis. Lo ideal sería que una proteína portadora introdujese un importante efecto de ayuda a un epítopo de célula B conjugado ("por ejemplo, un polisacárido) sin inducir una respuesta de anticuerpo contra sí mismo. El uso de inmunogénicos en el contexto de la mayor parte de las moléculas de histocompatibilidad mayor de complejos de clase II, es una aproximación a este objetivo [4], Dichos epítopos se han identificado dentro de TT y otras proteínas. De forma alternativa, podrían usarse proteínas portadoras de multi-epítopo, como las descritas en la referencia 5.

[4] Una vez que se ha conjugado un antígeno sacárido a una proteína portadora, la mezcla de la reacción debería purificarse para retirar la proteína portadora libre que no tiene conjugados antígenos sacáridos y sacáridos no conjugados.

[5] En este ámbito se conocen varios métodos para la purificación de proteína portadora libre y conjugada, incluida la cromatografía hidrofóbica, ultrafiltración tangencial, diafiltración, etc. [ver también las refs. 6 y 7, etc.]. De todas formas, estos métodos tienen varias desventajas. Por ejemplo, la referencia 8 propone el uso de filtración de gel para purificar los conjugados de GBS. Pero este método necesita un gran volumen de matriz de filtración de gel y es difícil de aplicar a escala industrial. Un método alternativo que implica la ultrafiltración, por ejemplo usando diafiltración de flujo tangencial con una membrana de 1KDa, no es eficaz a no ser que el antígeno sacárido tenga un peso molecular adecuado y de esa forma no es adecuado para los conjugados de GBS serotipo III conjugados u otros conjugados en los que el antígeno sacárido sea <1kDa. Además, la ultrafiltración puede tener como resultado una baja productividad y tensionar el conjugado.

[6] Por lo tanto, el objeto de este invento es proporcionar un método mejorado para purificar conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos a partir de impurezas como no conjugados de proteína portadora y no conjugados de sacáridos.

DIVULGACIÓN DEL INVENTO

[7] Se ha descubierto que el conjugado de sacáridos antígenos a proteínas portadoras puede modificar la capacidad de unión de las proteínas portadoras con la hidroxiapatita. Así, en una mezcla que incluya conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos, no conjugados de proteína portadora y otras proteínas, las proteínas contaminantes/no conjugadas se unen a la hidroxiapatita mientras que los conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos no se unen sustancialmente.

[8] Así, el invento proporciona un método para purificar conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos a partir de una mezcla que incluye proteína portadora libre y conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos, que incluye el contacto de dicha mezcla con de forma que la proteína portadora se una a la hidroxiapatita mientras los conjugados no se unan; y recoger los conjugados libres de proteínas de sacáridos portadores de antígenos. La proteína portadora no unida podría eluirse de la hidroxiapatita y reutilizarse en una reacción de conjugación, probarse o descartarse.

[9] La mezcla podría incluir conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos y proteínas no conjugadas. De todas formas, la mezcla también podría contaminarse con otras proteínas. El método del invento permite retirar cualquier proteína contaminante, proporcionando conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos purificados.

[1] El invento también proporciona un método para preparar un compuesto farmacológico, que incluye los

pasos para i) poner en contacto una mezcla que incluye conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos y proteína libre portadora con hidroxiapatita, ¡i) reunir los conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos libres, y i¡¡) mezclar dichos conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos que se han obtenido en el paso ii) con un diluyente farmacológicamente aceptable o portador. La presentación también proporciona los compuestos que se prepararon por dicho método.

Proteína portadora

[11] La proteína portadora podría seleccionarse a partir de las conocidas en esta técnica, como el tétanos toxoide (TT), la difteria toxoide (DT) o derivados de las mismas como el CRM197 no tóxico mutante de toxina de difteria [9-11], Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de membrana externa N.meningitidis

[12] , péptidos sintéticos [13,14], proteínas de choque térmico [15,16], proteínas de tos ferina [17,18], citoquinas [19], linfoquinas [19], hormonas [19], factores de crecimiento [19], proteínas artificiales incluidos epítopos múltiples de célula humana CD4+ T a partir de varios antígenos derivados de patógenos [2] como N19 [21], proteína D de H.influenzae [22-24], pneumolisina [25], proteína PspA[26] de superficie pneumocócica, proteínas de absorción de hierro [27], toxina A o B de C.difficile [28], etc. De todas formas, podría usarse cualquier proteína portadora mientras se una a la hidroxiapatita.

[12] La difteria toxoide (DT), el tétanos toxoide (TT) y CRM197 son los portadores principales que se usan actualmente en vacunas pediátricas como los conjugados HIBERIX y MENITORIX a partir de GSK usan TT como portador, el producto HIBTITER usa CRM197, los conjugados pneumocócicos de PREVENAR usan CRM197, los productos MENJUGATE y MENINGITEC usan CRM197, y NEISVAC-C usa TT.

[13] De forma alternativa, la proteína portadora podría ser una proteína portadora multi-epítope, como las descritas en la referencia 5. Dichos portadores multi-epítope incluyen N19.

[14] Preferiblemente, la proteína portadora usada en el invento será CRM197.

Antígeno sacáridos

[15] El antígeno sacárido conjugado a la proteína portadora de un compuesto purificado por el invento es un sacárido capsular bacteriano. También podría usarse LPS o LOS como antígeno.

[16] Preferiblemente, el antígeno sacárido de acuerdo con el invento tendrá un peso molecular de 5KDa o más, y mejor todavía 8KDa o más (por ejemplo, 1, 15, 2, 25, 3, 35, 4, 45, 5, 6, 7, 8, 9, 1, 125, 15, 175, 2, 225, 25KDa o más).

[17] Entre los ejemplos de sacáridos bacterianos capsulares que podrían incluirse en los compuestos del invento se incluyen sacáridos capsulares a partir de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B, C, W135 y/o Y), Streptococcus pneumoniae (serotipos 1,2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 1A, 11 A, 12F, 14,15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 2, 22F, 23F y 33F, concretamente 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y/o 23F), Streptococcus agalactiae (tipos la, Ib, II, III, IV, V, VI, Vil, y/o VIII, como los sacáridos antígenos descritos en las referencias 29-32), Haemophilus influenzae (cepas tipificables: a, b, c, d, e y/o f), Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (a partir de, por ejemplo, los serotipos 5 y 8), Enterococcus faecalis o E.faecium (repeticiones de trisacárido), Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Klebsiella spp., etc. Otros sacáridos que podrían incluirse en los compuestos del invento incluyen glucanos (por ejemplo, glucanos fúngicos, como los de Candida albicans), y sacáridos capsulares fúngicos, por ejemplo a partir de la cápsula de Cryptococcus neoformans. Otro sacárido que podría incluirse es el antígeno específico de grupo Streptococcus pyogenes (carbohidrato de GAS).

Entre los ejemplos de LPS y LOS se incluye LPS aislado a partir de serotípo PA1.5 de Pseudomonas aeruginosa.

[18] La cápsula de serogrupo A N.meningitidis (MenA) es un homopolímero de (a1>6)-unido a N-acetil-D- manosamina-1 -fosfato, con O-acetílacíón parcial en las posiciones C3... [Seguir leyendo]

1. Un método para purificar conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos a partir de una mezcla que incluye proteína de portador libre y conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos, y también podría incluir proteínas contaminantes, que incluye:

el contacto de dicha mezcla con hidroxiapatita de forma que la proteína portadora se una a la

hidroxiapatita mientras los conjugados no se unen;

y la recolección de los conjugados libres de proteínas de sacáridos portadores de antígenos; donde el

antígeno sacárido es un sacárido capsular bacteriano.

2. El método de la reivindicación 1, donde la proteína portadora se selecciona a partir de toxoide del tétanos, toxoide de difteria, CRM197, proteínas de la membrana externa de N-meningitidis, proteínas sintéticas, proteínas de choque térmico, proteínas de tos ferina, citocinas, linfoquinas, hormonas, factores del crecimiento, portadores de poli-epítopo, proteína D de H.influenzae, pneumolisina, proteína PspA de la superficie neumocócica, proteínas de absorción de hierro, toxina A o B de C.difficile y/o un portador de poliepítopo como N19.

3. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde dicha proteína portadora sea toxoide del tétanos; toxoide de difteria o CRM197.

4. El método de cualquier reivindicación anterior donde el antígeno sacárido tenga un peso molecular de 5kDa o más, preferiblemente 5kDa o más.

5. El método de cualquier reivindicación anterior donde el antígeno sacárido sea glicosilado.

6. El método de cualquier reivindicación anterior donde el antígeno sacárido proceda de N.meningitidis, S.pneumoníae, S.agalactiae, H.influenzae, P.aeruginosa, S.aureus, E.faecalis, E.faecium, Y.enterocolitica, V.cholerae o S.typhi.

7. El método de la reivindicación 6 donde el antígeno sacárido proceda de los serotipos la, Ib, II, III & V de S.agalactiae.

8. El método de cualquier reivindicación anterior donde la proteína portadora se conjugue a los sacáridos antígenos a partir de una especie bacteriana o más de una.

9. El método de cualquier reivindicación anterior, donde el antígeno sacárido se conjugue a la proteína portadora por medio de un ligando.

1. El método de cualquier reivindicación anterior, donde dicho método se lleva a cabo a pH6.5-pH7.5, preferiblemente a pH7.2.

11. El método de cualquier reivindicación anterior donde dicho método se lleve a cabo a una concentración de fosfato de 5mM o menos.

12. El método de cualquier reivindicación anterior donde dicha hidroxiapatita:

(i) esté en forma de un gel,

(ii) tiene un tamaño de partícula de 4pm o más, y/o

(iii) tiene una capacidad dinámica de unión de >1mg lisozimas por gramo.

13. Un método para preparar un compuesto farmacéutico, que incluye el método de cualquier reivindicación anterior, y también incluye el paso iii) mezcla de dichos conjugados de proteínas de sacáridos portadores de antígenos obtenidos en el paso ii) con un diluyente o portador aceptable farmacológicamente.

14. El método de la reivindicación 13, además añadiendo el paso (iv) mezcla del producto del paso (iii) con un adyuvante.

15. El método de la reivindicación 13 o reivindicación 14, donde el compuesto incluya uno o más antígenos.