Pseudotipificación de vectores retrovíricos, métodos para su producción y su uso para la transferencia de genes dirigida y la selección de alta capacidad de procesamiento.

Una partícula de vector lentivírico pseudotipificado que comprende una proteína de fusión (F) y de hemaglutinina (H) de un morbillivirus,

en la que las porciones citoplásmicas de dichas proteínas F y H están truncadas por la deleción de restos aminoácidos de dichas porciones citoplásmicas, y

en la que la porción citoplásmica truncada de la proteína F comprende al menos 1 resto aminoácido de carga positiva y no más de 9 restos aminoácidos consecutivos, según se cuenta desde el extremo N-terminal de la porción citoplásmica de la proteína F,

y la porción citoplásmica truncada de la proteína H está truncada para permitir una pseudotipificación eficaz y tiene una función de apoyo a la fusión,

en la que la porción citoplásmica truncada de la proteína H comprende al menos 9 y no más de 19 restos aminoácidos consecutivos, según se cuenta desde el extremo C-terminal de la porción citoplásmica de la proteína H más una metionina adicional en el N-terminal.

Pseudotipificación de vectores retrovíricos, métodos para su producción y su uso para la transferencia de genes dirigida y la selección de alta capacidad de procesamiento

Campo de la invención

La invención se refiere a la pseudotipificación de vectores retrovíricos con proteínas de la envuelta heterólogas derivadas de la familia Paramyxoviridae, género Morbillivirus, y a diversos usos de las partículas de vector resultantes.

Antecedentes de la invención

Comparados con otros sistemas de transferencia de genes, los vectores retrovíricos ofrecen una amplia gama de ventajas, que incluyen su capacidad para transducir una diversidad de tipos celulares, integrar de modo estable el material genético transferido en el genoma de la célula hospedante diana, y expresar el gen transducido a niveles significativos. Por tanto, los vectores derivados de los gamma-retrovirus, por ejemplo, el virus de la leucemia murina (MLV), se han convertido en una herramienta convencional para la tecnología de la transferencia de genes y se han empleado con frecuencia en ensayos de terapia génica clínicos (Ross et al., Hum. Gen Ther., 7:1781-179, 1996). Además, también se ha descrito previamente el uso de estos vectores para el tratamiento de diferentes inmunodeficiencias monogenéticas.

La pseudotipificación de vectores retrovíricos, que incluyen vectores de VIH o vectores de MLV, se refiere a la incorporación de proteínas de la envuelta de virus heterólogos en la membrana de la envuelta retrovírica. Estos vectores retrovíricos pseudotipificados entonces muestran un fenotipo de receptor similar al virus del cual se deriva la proteína de la envuelta. Dependiendo de la gama de hospedantes de dicho virus, los vectores retrovíricos pseudotipificados tendrán entonces una gama de hospedantes más amplia o más estrecha, comparado con las partículas de vectores que tienen las proteínas de la envuelta retrovíricas homologas incorporadas.

Se han descrito una serie de vectores pseudotipificados, que incluyen vectores de MLV pseudotipificados con la proteína Env de VIH, la gllcoproteína del virus de Ébola, o la glicoproteína de baculovirus. En todos estos vectores conocidos se empleó una única proteína de la envuelta para lograr la pseudotipificación deseada.

El virus del sarampión (MeV), un morbillivirus prototípico del género Paramyxoviridae, utiliza dos glicoproteínas de la envuelta (la proteióna de fusión (F) y la proteína de hemaglutinina (H)) para conseguir entrar en la célula diana. La proteína F es un tipo de proteína transmembrana I, mientras que la proteína H es un dominio transmembrana de tipo II, es decir su amino terminal está expuesto directamente a la región citoplásmica. Así, ambas proteínas comprenden una reglón transmembrana y una región citoplásmica. Una función conocida de la proteína F es la mediación en la fusión de membranas víricas con las membranas celulares de la célula hospedante. Las funciones atribuidas a la proteína H incluyen el reconocimiento del receptor sobre la membrana diana y el apoyo a la proteína F en su función de fusión a la membrana. La fusión a la membrana directa y muy eficaz en la superficie de la membrana celular es una propiedad particular del virus del sarampión y los morbillivirus, que los distingue de muchos otros virus con envuelta que son endocitados y que solo se fusionan tras la disminución en el pH que se produce con la endocitosis. Ambas proteínas están organizadas sobre la superficie vírica en una disposición regular de picos muy cercanos entre sí, tetrámeros de H y trímeros de F (Russell et al., Virology, 199:16-168, 1994).

La cepa Edmonton de MeV (MeVedm) emplea una única proteína como su receptor principal, concretamente, la proteína conocida por ser la reguladora del factor de activación del complemento, CD46 (Gerlier et al., Trends MIcroblol., 3:338-345, 1995). La CD46 se expresa sobre todas las células humanas nucleadas. Sin embargo, la mayoría de los aislados clínicos del virus del sarampión no pueden utilizar la CD46 como receptor con eficacia. La SLAM humana (molécula de activación de linfocitos de señalización, también denominada CDw15) es una glicoproteína de membrana descubierta recientemente que se expresa sobre algunas células T y B, y también se ha descubierto que actúa como receptor celular para MeV, incluyendo la cepa Edmonston (Tatsuo et al., Nature, 46(6798):893-897, 2).

El documento EP 1 291 419 A1 describe un vector retrovírico que contiene una proteína de membrana que tiene actividad hemaglutinina. El vector vírico es útil para la transferencia de genes hacia las células hospedantes. El documento EP 1 548 11 A1 describe métodos para producir un vector vírico que comprende una proteína de membrana que se une al ácido siálico como componente de la envuelta, que emplea neuraminidasa (NA) derivada de bacterias Gram-positivas. El vector vírico puede utilizarse para trasladar genes hacia células y se ha sugerido para la terapia génica. Aunque los documentos EP 1 291 419 A1 y EP 1 548 11 A1 describen proteínas H y F de longitud completa, estos documentos no mencionan las proteínas H y F truncadas.

Las funciones biológicas e interacciones precisas de las proteínas H y F de MeV siguen sin estar claras en gran medida. Sin embargo, en experimentos en los que se incorporan proteínas H y F truncadas en partículas de vector de MeV producidas de modo recombinante (rMeV) (Molí et al., J. Virol., 76:7174-7186, 22) se concluyó que el rMeV que contiene la proteína F truncada no presenta diferencias con el MeV de tipo salvaje (wt MeV) con respecto a la inducción de la formación del sincitio o a la producción de virus infecciosos. Sin embargo, el rMeV que contiene

la proteína H truncada muestra una inducción gravemente reducida de la formación del sincitio y una disminución en la producción de virus infecciosos. Así, el truncamiento de las proteínas F y H produce, de manera diferencial, una disminución en las titulaciones o no produce ningún efecto en absoluto.

A la vista de la importancia de los vectores retrovíricos pseudotipificados para numerosas aplicaciones clínicas y de la tecnología de transferencia de genes, siguen siendo necesarios otros vectores retrovíricos pseudotipificados mejorados y métodos para generar y utilizar dichos vectores.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el inesperado descubrimiento de que la utilización de una combinación de proteínas H y F de morbillivirus truncadas para generar las partículas de vector lentivírico pseudotipificado produce un aumento significativo en las titulaciones y en la eficacia de la transducción de las partículas de vector vírico resultantes. Además, y de modo inesperado, una cantidad mayor de proteína F truncada, en comparación con la proteína H truncada, dentro de las partículas de vector lentívirico generadas, conduce a una mayor titulación y una mayor eficacia de la transducción de dichas partículas de vector lentivírico.

La invención puede definirse mediante las reivindicaciones adjuntas. Se describe una partícula de vector lentivírico pseudotipificado que comprende una proteína de fusión (F) y de hemaglutinina (H) de un morbillivirus, en la que las porciones citoplásmicas de dichas proteínas F y H están truncadas, y en la que la porción citoplásmica truncada de la proteína F comprende al menos un resto aminoácido de carga positiva, y la porción citoplásmica truncada de la proteína H está truncada para permitir una pseudotipificación eficaz y tiene una función de apoyo a la fusión.

En una realización, la invención se dirige a una partícula de vector lentivírico pseudotipificado que comprende una proteína de fusión (F) y de hemaglutinina (H) de un morbillivirus, en la que las porciones citoplásmicas de dichas proteínas F y H están truncadas por la deleción de restos aminoácidos de dichas porciones citoplásmicas, y en la que la porción citoplásmica truncada de la proteína F comprende al menos 1 resto aminoácido de carga positiva y no más de 9 restos aminoácidos consecutivos, según se cuenta desde el extremo N-terminal de la porción citoplásmica de la proteína F, y la porción citoplásmica truncada de la proteína H está truncada para permitir una pseudotipificación eficaz y tiene una función de apoyo a la fusión, en la que la porción citoplásmica truncada de la proteína H comprende al menos 9 y no más de 19 restos aminoácidos consecutivos, según se cuenta desde el extremo C-terminal de la porción citoplásmica de la proteína H más una metionina adicional en el N-terminal.

En otra realización, la partícula de vector lentivírico pseudotipificado de la invención comprende una proteína... [Seguir leyendo]

1.- Una partícula de vector lentivírico pseudotipificado que comprende una protelna de fusión (F) y de hemaglutinina (H) de un morbillivirus, en la que las porciones citoplásmicas de dichas proteínas F y H están truncadas por la deleción de restos aminoácidos de dichas porciones citoplásmicas, y

en la que la porción citoplásmica truncada de la proteína F comprende al menos 1 resto aminoácido de carga positiva y no más de 9 restos aminoácidos consecutivos, según se cuenta desde el extremo N-terminal de la porción citoplásmica de la proteína F,

y la porción citoplásmica truncada de la proteína H está truncada para permitir una pseudotipificación eficaz y tiene una función de apoyo a la fusión,

en la que la porción citoplásmica truncada de la proteína H comprende al menos 9 y no más de 19 restos aminoácidos consecutivos, según se cuenta desde el extremo C-terminal de la porción citoplásmica de la proteína H más una metionina adicional en el N-term¡nal.

2.- La partícula de vector lentivírico pseudotipificado según la reivindicación 1, en la que el morbillivirus es un virus del sarampión, o la cepa Edmonston del virus del sarampión, o

en la que la porción citoplásmica truncada de la proteína F comprende al menos 3 restos aminoácidos consecutivos, según se cuenta desde el extremo N-termlnal de la porción citoplásmica de la proteína F, y la porción citoplásmica truncada de la proteína H comprende al menos 13 restos aminoácidos consecutivos, según se cuenta desde el extremo C-termlnal de la porción citoplásmica de la proteína H más una metionina adicional en el N-termlnal,

en la que de uno a cuatro de los restos aminoácidos N-terminales de dichos al menos 13 restos aminoácidos consecutivos, según se cuenta desde el extremo C-terminal de la porción citoplásmica de la proteína H, pueden estar reemplazados por restos alanlna,

o en la que la partícula lentivírica pseudotlplflcada se deriva de un lentivirus seleccionado del grupo que consiste en VIH-1, VIH-2, SlVmac, SlVpbj, SlVagm, FIV y EIAV, o

en la que la proteína F truncada es FcA24 o FcA3 y/o la proteína H truncada se selecciona del grupo que consiste en HcA14, HcA15, HcA16, HcA17, HcA18, HcA19, HcA12, HcA21+A y HcA24+4A.

3 - La partícula de vector lentivírico pseudotipificado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

en la que dicha partícula de vector es capaz de transducir células que expresan al menos uno de CD46 o SLAM, o que es capaz de transducir selectivamente células que expresan SLAM, en la que opcionalmente dicha partícula de vector es capaz de transducir células seleccionadas del grupo que consiste en células HT18, HEK-293T, U-87MG, A31 y A-431.

4 - La partícula de vector lentivírico pseudotipificado según las reivindicaciones 1-2, en la que la proteína H truncada es una proteína quimérica que no interacciona con CD46 o SLAM, y que también tiene un anticuerpo monocatenario, un factor del crecimiento o un ligando con un marcador de la superficie celular en su ectodominio,

en la que opcionalmente el anticuerpo monocatenario o el ligando se dirige contra o se une a un marcador de un cúmulo de diferenciación (CD), un antígeno tumoral expuesto sobre la superficie celular, un receptor de tirosina quinasa, un receptor de un factor del crecimiento, un receptor de quimioquina, un receptor acoplado a proteína G, un receptor olfativo, una proteína vírica expuesta sobre la superficie de células crónicamente infectadas, un receptor de neurotransmisores, un receptor del factor de células pluripotenciales, y un receptor del factor del crecimiento nervioso,

en la que opcionalmente el anticuerpo monocatenario o el ligando se dirige contra o se une a una molécula seleccionada del grupo que consiste en CD4, CD8, CD34, CD2, CD19, CD33, CD133, EGF-R y VEGFR-2, mucina- 1, el receptor de dopamina, el receptor de acetilcolina, el receptor GABA, EGF-R, VEGFR-2, la proteína gp12 de VIH, (HGF), un receptor del factor del crecimiento epidérmico, un receptor del factor del crecimiento endotelial vascular, un receptor del factor del crecimiento de hepatocitos, un receptor de interleuquinas y/o un receptor de citoquinas y un receptor de eritropoyetina,

en la que opcionalmente la proteína H truncada se define mediante la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4.

5.- La partícula de vector lentivírico pseudotipificado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

en la que la cantidad de proteína F truncada presente en dicha partícula de vector es mayor que la cantidad de proteína H truncada presente en dicha partícula de vector,

en la que opcionalmente la cantidad de proteína F truncada es 1-1% mayor, es 1-25% mayor, es 25-5%

mayor, es 5-75% mayor, es 75-1% mayor, es más del 1% mayor, y preferiblemente es 7% mayor que la cantidad de la proteína H truncada.

6.- La partícula de vector lentivírico pseudotipificado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un vector de expresión de ARN psi-positivo,

en la que opcionalmente el vector de expresión de ARN psi-positivo comprende al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen de un marcador seleccionable, un gen que codifica una proteína fluorescente, un gen que codifica un gen de resistencia a antibióticos, un gen que codifica ARNsi, un gen que codifica ARNsh, un gen que codifica un factor angiogénico, un gen que codifica un factor apoptótico, un gen que codifica un factor citotóxico, un gen que codifica un factor antiapoptótico, un gen que codifica un factor neuroprotector, un gen que codifica un antígeno vírico o bacteriano, un gen que codifica una proteína antivírica, un gen que codifica un antígeno tumoral, un gen que codifica un factor inmunoestimulador, y una copia funcional de un gen defectuoso o mutado en un paciente que padece una enfermedad heredada,

en la que opcionalmente el gen se selecciona del grupo que consiste en un gen que codifica GFP, un gen que codifica eGFP, un gen que codifica una proteína inductora de la apoptosis, un gen que codifica una proteína citotóxica, un gen TNF-a, un gen p53, un ARN de interferencia, un gen de interferón, el gen de timidina quinasa del herpes virus, y un gen que codifica una proteína inmunoestimuladora.

7.- Una composición farmacéutica que comprende la partícula de vector lentivírico pseudotipificado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que opcionalmente comprende también un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8.- El uso de la partícula de vector lentivírico pseudotipificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la preparación de un medicamento.

9.- El uso de la partícula de vector lentivírico pseudotipificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de al menos un trastorno en un sujeto, en el que el trastorno se selecciona del grupo que consiste en una infección crónica, la inmunodeficiencia SCID-X1, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad neurodegenerativa, cáncer, VIH, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, diabetes, una enfermedad neuroinflamatoria, una enfermedad reumática, una enfermedad autoinmunológica, adipositis, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide, y carcinoma renal.

1.- El uso de las partículas de vector lentivírico pseudotipificado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la identificación de tipos celulares definidos, en el que opcionalmente la identificación se realiza en poblaciones de células vivas o en cultivos de órganos para condiciones en vivo.

11.- Una molécula de ácido nucleico, en la que la molécula de ácido nucleico se define mediante la secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, en la que opcionalmente dicha molécula de ácido nucleico es parte de un plásmido o de un plásmido de expresión.

12 - Un método para producir una partícula de vector lentivírico pseudotipificado, que comprende:

cotransfectar una línea celular encapsulante con un gen gag/pol lentivírico psi-negativo, un vector de expresión lentivírico psi-positivo, y uno o dos vectores de expresión psi-negativos que codifican las proteínas H y F de morbillivirus truncadas de la reivindicación 1,

en el que opcionalmente la línea celular encapsulante expresa de forma estable uno o más de los genes codificados por el gen gag/pol lentivírico psi-negativo, el vector de expresión lentivírico psi-positivo, o uno o dos vectores de expresión psi-negativos que codifican las proteínas H y F truncadas del virus del sarampión.

13 - Un método para seleccionar anticuerpos en un sistema de mamífero, que comprende:

(a) proporcionar un banco de partículas de vector lentivírico pseudotipificado que comprende una pluralidad de diferentes partículas de vector lentivírico pseudotipificado según la reivindicación 4, en el que las proteínas H truncadas de las partículas lentivíricas pseudotipificadas tienen un anticuerpo monocatenario diferente en su ectodominio, y las partículas comprenden también un vector de expresión lentivírico bicistrónico, en el que dicho vector de expresión codifica el anticuerpo monocatenario de la respectiva partícula lentivírica pseudotipificada y un gen indicador expresable;

(b) poner en contacto una población de células que expresan un marcador celular con el banco de la etapa (a), bajo condiciones que permiten la transducción de las células por dichas partículas de vector;

(c) seleccionar las células que expresan el gen indicador expresable transducido por una partícula de vector lentivírico pseudotipificado de la etapa (a); y

(d) determinar la información genética del anticuerpo monocatenario de la partícula de vector lentivírico pseudotipificado que transduce la célula a partir de las células seleccionadas de la etapa (c).

14.- Un método para la detección o la selección de células que expresan un marcador celular específico, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar una partícula de vector lentivírlco pseudotipificado según la reivindicación 4, en el que la proteína H truncada de dicha partícula de vector tiene una anticuerpo monocatenario o un ligando con dicho marcador celular específico en su ectodominio, y dicha partícula de vector comprende también un vector de expresión, en el que dicho vector de expresión codifica un gen indicador expresable;

(b) poner en contacto la partícula de vector lentivírico pseudotipificado de la etapa (a) con al menos una célula bajo condiciones que permiten la transducción de dicha al menos una célula por dicha partícula de vector; y

(c) detectar o seleccionar la célula o células que expresan el gen indicador expresable.

15.- Un método para identificar el antígeno de un anticuerpo o el receptor de un ligando, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar una partícula de vector lentivírlco pseudotipificado según la reivindicación 4, en el que la proteína H truncada de dicha partícula de vector tiene un anticuerpo monocatenario o un ligando conocido en su ectodominio dirigido contra o que se une a un antígeno o a un receptor sobre una célula, y dicha partícula de vector comprende también un vector de expresión, en el que dicho vector de expresión codifica un gen indicador expresable;

(b) transducir células con un banco de expresión de la célula de la etapa (a);

(c) poner en contacto la partícula de vector lentivírico pseudotipificado de la etapa (a) con las células transducidas de la etapa (b);

(d) seleccionar las células que expresan el gen indicador expresable; y

(e) determinar la información genética del antígeno o del receptor a partir de las células seleccionadas de la etapa

(d).

16.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que el gen Indicador expresable es un gen que codifica un producto génico seleccionado del grupo de un gen de un marcador seleccionare, un gen que codifica una proteína fluorescente, un gen que confiere resistencia a antibióticos, neomicina, eGFP y GFP, o

en el que la población de células expresa en la naturaleza el marcador celular, el antígeno o el receptor, o en el que la población de células ha sido transfectada de modo transitorio o estable para que exprese dicho marcador celular, antígeno o receptor, o

en el que el marcador celular, el antígeno o el receptor se selecciona del grupo que consiste en CD4, CD8, CD34, CD2, CD19, CD33, CD133, EGF-R y VEGFR-2, mucina-1, el receptor de dopamina, el receptor de acetilcollna, el receptor GABA, EGF-R, VEGFR-2, la proteína gp12 de VIH, (HGF) y eritropoyetina.