Producción fotocatalítica de hidrógeno en cianobacterias.

Una célula cianobacteriana que comprende una proteína de fusión de la subunidad IX del centro de reacción del Fotosistema I (PsaJ) y el precursor de la subunidad III del centro de reacción del Fotosistema I (PsaF),

en el que dicho PsaF está truncado por al menos diez aminoácidos en su extremo N y en el que dicho complejo PSI acepta electrones de al menos un citocromo respiratorio, comprendiendo adicionalmente la célula una enzima hidrogenasa unida a una ferredoxina heteróloga.

Producción fotocatalítica de hidrógeno en cianobacterias CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la generación de hidrógeno en cianobacterias y a polinucleótidos aislados para lo mismo.

El desarrollo de un aporte energético limpio, económicamente viable y sostenible, para el futuro es uno de los retos más urgentes de nuestra generación. Se espera que la producción de petróleo aumente en un futuro próximo y que las reservas de petróleo económicamente viables se agoten en gran medida en el 2050. Un ahorro de hidrógeno requiere formas limpias, económicas y sostenibles para generar hidrógeno. La producción actual de hidrógeno depende casi por completo del uso de fuentes no renovables (es decir reformación de vapor de gas natural, gasificación de carbón y electrolisis de agua accionada por energía nuclear) . Aunque inicialmente estas estrategias probablemente impulsan una transición hacia un ahorro de hidrógeno, el hidrógeno producido es más caro y contiene menos energía que la fuente de energía no renovable de la que procede. Además el uso de combustibles fósiles y de energía nuclear es insostenible. Por lo tanto, existe una clara necesidad de establecer medios de producción de hidrógeno que sean económicamente viables.

Dado que la fuente de energía principal es la energía solar, una opción particularmente deseable es la producción de hidrógeno usando maquinaria fotosintética. Los dos núcleos de la maquinaria fotosintética en plantas, algas y cianobacterias son los dos centros de reacción fotoquímicos conocidos como Fotosistema I (FSI) y Fotosistema II (FSII) . El FSII impulsa la reacción más altamente oxidante que se sabe que se produce en la biología, la división del agua en oxígeno, protones y electrones. El oxígeno se libera a la atmósfera y es el responsable de la conservación de la vida aerobia en la Tierra. Los electrones derivados pasan a lo largo de la cadena de transporte de electrones fotosintética desde el FSII mediante la Plastoquinona (PQ) al Citocromo b6f (cit b6f) y al Fotosistema I (FSI) . A partir del FSI, la mayoría del potencial redox negativo se estabiliza en forma de ferredoxina (Fd) reducida que sirve como un donador de electrones para la enzima ferredoxin-NADP+-reductasa (FNR) . En condiciones fisiológicas normales la Fd reduce el NADP+ a NADPH mediante el complejo Fd-FNR. En un proceso paralelo (fotofosforilación) , los H+ se liberan en el lumen tilacoidal donde generan un gradiente de H+ que se usa para impulsar la producción de ATP mediante la ATP sintasa. Posteriormente, la NADPH y el ATP se usan para producir almidón y otras formas de biomasa de almacenamiento energético.

Algunas algas verdes y cianobacterias han desarrollado la capacidad de canalizar los protones y los electrones almacenados en el almidón en la producción de hidrógeno en condiciones anaerobias expresando una enzima hidrogenasa. [Wunschiers, Stangier et al. 2001, Curr Microbiol 42 (5) : 353-60; Happe y Kaminski 2002, Eur J Biochem 269 (3) : 1022-32]. La enzima hidrogenasa se localiza en el estroma del cloroplasto y obtiene electrones de la ferredoxina o flavodoxina que reduce el Fotosistema I y por tanto compite con la FNR por los electrones generados por el FSI. Sin embargo, el oxígeno es un fuerte inhibidor de la enzima hidrogenasa y por tanto, la generación de hidrógeno en estos organismos es solo transitoria. El reto más importante en la producción de hidrógeno fotosintético es su separación espacial y/o temporal de la producción de oxígeno.

Intentos realizados para generar hidrogenasas de algas tolerantes al oxígeno no han tenido mucho éxito [Seibert et al. 2001, Strategies for improving oxygen tolerance of algal hydrogen production. Biohydrogen II. J. M. Miyake, T.; San Pietro, A., eds, Oxford, RU: Pergamon 67-77]. McTavish et al [J Bacteriol 177 (14) : 3960-4, 1995] han mostrado que la mutagénesis dirigida de la hidrogenasa de Azotobacter vinelandii puede hacer que la producción de hidrógeno sea insensible a la inhibición de oxígeno, pero con una pérdida sustancial (78 %) de la actividad de la evolución de hidrógeno.

Los cloroplastos de plantas y algas y las membranas de cianobacterias fotosintéticas contienen dos fotosistemas: el FSII que actúa como mediador en la transferencia de electrones a partir del agua (el donador inicial de electrones) al grupo de plastoquinona y el FSI que actúa como mediador en la transferencia de electrones de la plastocianina a la ferredoxina, generando de esta manera la energía reductora necesaria para la fijación del CO2 en forma de NADPH. Aunque ahora se sabe que el FSII es sensible a fotolesión, se considera que el FSI es más estable que el FSII. Por lo tanto, es concebible que la prevención del ensamblaje del FSII debería dar como resultado su rápida inactivación a la luz del sol y el cese de la disociación del agua (y de la generación de oxígeno) . Melis (Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2001/005343) explica un proceso en el que la inhibición de la actividad hidrogenasa se elevaba separando temporalmente la reacción de disociación de agua generadora de oxígeno, catalizada por el FSII, de la producción de hidrógeno sensible a oxígeno catalizada por la Hidrogenasa (HidA) de los cloroplastos. Esta separación se realizó cultivando primero algas verdes en presencia de azufre para construir reservas de un sustrato endógeno y después en ausencia de azufre. La eliminación del azufre da como resultado la inactivación del Fotosistema II de tal manera que la respiración celular conduce a anaerobiosis, a la inducción de hidrogenasa y a una evolución de hidrógeno sostenida en la luz.

Sin embargo, el proceso de Melis está sujeto a limitaciones prácticas considerables. La tasa real de acumulación de

gas hidrógeno es como máximo del 15 al 20 % de la capacidad fotosintética de las células [Melis y Happe 2001, Plant Physiol. Nov; 127 (3) : 740-8] y sufre la limitación intrínseca de que la producción de hidrógeno por privación de azufre de las algas no puede continuar indefinidamente. El rendimiento comienza a nivelarse y disminuye después de aproximadamente 40-70 horas de privación de azufre. Después de aproximadamente 100 horas de privación de azufre la algas necesitan volver a una fase de fotosíntesis normal para restablecer los sustratos endógenos.

La Publicación Internacional Nº WO 03/067213 describe un proceso para la producción de hidrógeno usando Chlamydomonas reinhardtii en el cual las algas se han modificado genéticamente para regular negativamente la expresión de una sulfato permeasa, CrcpSulP, a través de la inserción de una secuencia antisentido. Se dice que esto hace que las técnicas de privación de azufre de la técnica anterior sean obsoletas, dado que obvia la necesidad de eliminar físicamente los nutrientes de azufre del medio de crecimiento para inducir la producción de hidrógeno. La captación de azufre reducida por las células usando esa técnica no sólo da como resultado una disminución sustancial de los niveles de las principales proteínas de los cloroplastos, tales como Rubisco, D1 y LHCII, sino que también priva a la célula de azufre para su uso en la biosíntesis de otras proteínas.

Ihara et al (Ihara, Nakamoto et al. 2006; Ihara, Nishihara et al. 2006) muestran una proteína de fusión que comprende una hidrogenasa [NiFe] unida a membrana (de la β-proteobacteria Ralstonia eutropha H16) y la subunidad periférica del FSI, la PsaE de la cianobacteria Thermosynechococcus elongatus como un sistema de conversión directa de luz a hidrógeno. El complejo hidrogenasa aislada-FSI aislado presentó una producción de hidrógeno accionada por la luz a una tasa de [0, 58 μmol de H2]/[mg de clorofila] h in vitro. Se piensa que la ineficacia de este sistema deriva de la mala capacidad de la hidrogenasa para aceptar electrones en comparación con la capacidad del FSI para donar electrones.

Peters et al [Science, 282, 4 Dec, 1998] muestran el aislamiento de una hidrogenasa solo de Fe de Clostridium pasteurianum que naturalmente comprende estructuras similares a la ferrodoxina. Aunque esta hidrogenasa es posiblemente capaz de generar directamente hidrógeno en condiciones iluminadas, aún está inhibida por el oxígeno.

Existe por tanto una necesidad ampliamente reconocida para, y sería muy ventajoso tener, un proceso sostenible y eficaz para la producción fotosintética de hidrógeno que no tuviese las limitaciones anteriores.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una célula cianobacteriana que comprende una proteína de fusión de la subunidad IX del centro de reacción del Fotosistema I... [Seguir leyendo]

1. Una célula cianobacteriana que comprende una proteína de fusión de la subunidad IX del centro de reacción del Fotosistema I (PsaJ) y el precursor de la subunidad III del centro de reacción del Fotosistema I (PsaF) , en el que dicho PsaF está truncado por al menos diez aminoácidos en su extremo N y en el que dicho complejo PSI acepta electrones de al menos un citocromo respiratorio, comprendiendo adicionalmente la célula una enzima hidrogenasa unida a una ferredoxina heteróloga.

2. La célula de la reivindicación 1, que es termófila. 10

3. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos de dicha proteína de fusión es al menos el 80 % idéntica a la expuesta en la SEC ID Nº : 1.

4. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos de dicha fusión es como se expone en la 15 SEC ID Nº : 1.

5. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos de dicha subunidad PsaF se expone en la SEC ID Nº : 14

6. La célula de la reivindicación 1, en la que un polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión está insertado en el genoma de la célula.

7. La célula de la reivindicación 1, que produce hidrógeno a una temperatura por encima de aproximadamente 55 º C.

8. Un polinucleótido aislado, que codifica un polipéptido como se expone en la SEC ID Nº : 1.

9. El polinucleótido aislado de la reivindicación 8 como se expone en la SEC ID Nº : 2 o SEC ID Nº : 6.

10. La célula de la reivindicación 1, en la que dicho al menos un citocromo respiratorio es el citocromo C o el 30 citocromo M.

11. La célula de la reivindicación 1, en la que dicha proteína de fusión es una proteína recombinante.

12. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 80 % idéntica a la secuencia 35 como se expone en la SEC ID Nº : 1.

13. El polipéptido aislado de la reivindicación 12, que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº : 1.

14. Un biorreactor para producir hidrógeno, que comprende (i) una tubería que comprende las células de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 10 y 11, en el que una primera sección de dicha tubería se coloca en un primer depósito que se mantiene a una temperatura de aproximadament.

6. 70 º C y una segunda sección de dicha tubería se coloca en un segundo depósito que se 45 mantiene a una temperatura de aproximadament.

3. 50 º C;

(ii) una bomba de recirculación configurada de tal manera que dichas células circulan a través de dicha tubería.

15. Un método para producir gas hidrógeno, comprendiendo el método cultivar la célula cianobacteriana de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 10 y 11 en condiciones que generen gas hidrógeno en la célula 50 cianobacteriana, produciendo de este modo gas hidrógeno.