Células aisladas y poblaciones que comprenden a las mismas para el tratamiento de enfermedades del SNC.

Un método para generar células similares a astrocitos, que comprende:

(a) incubar células madre mesenquimales en un medio que comprende un factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF) y un factor de crecimiento básico de fibroblastos humano (hbFGF) para generar células predispuestas a generar células similares a astrocitos ; y

(b) incubar dichas células predispuestas en un medio de diferenciación que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y una neurregulina 1-ß1 humana, generando de este modo células similares a astrocitos.

Células aisladas y poblaciones que comprenden a las mismas para el tratamiento de enfermedades del SNC CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente Invención se refiere a las realizaciones tal como se caracterizan en las reivindicaciones. También se describen en el presente documento células y poblaciones de las mismas que se pueden usar para tratar enfermedades del SNC.

La enfermedad de Parkinson es un trastorno relacionado con la edad caracterizado por una pérdida progresiva de las neuronas productoras de dopamina en la sustancia negra del mesencéfalo, que a su vez conduce a la pérdida progresiva de funciones motoras que se manifiesta a través de síntomas tales como temblor, rigidez y ataxia.

Las estrategias actuales de tratamiento para la EP se centran en restaurar el empobrecimiento de dopamina, generalmente a través de la administración del precursor de dopamina L-DOPA (L-3-4-dih¡drox¡fenilalanina). L- DOPA, (el precursor de la dopamina que penetra en la barrera hematoencefálica (BHE)), aumenta con éxito la síntesis y liberación de dopamina. Sin embargo, mientras la enfermedad progresa, existen menos neuronas dopaminérgicas disponibles para sintetizar dopamina a partir del precursor y la efectividad del tratamiento disminuye mientras que aparece la discinesia inducida por L-DOPA. Otros tratamientos con agonistas de la dopamina, inhibidores de la monoaminooxidasa o inhibidores de COMT también demuestran una mejoría parcial pero no pueden prevenir la progresión de la enfermedad.

Se ha sugerido el trasplante de células como una opción de tratamiento alternativa para reparar y reemplazar las neuronas dopaminérgicas perdidas. Para que dicha terapia de reemplazo funcione, las células implantadas deben sobrevivir e integrarse, tanto funcionalmente como estructuralmente, dentro del tejido dañado.

Se ha sugerido recientemente uso de células madre como una fuente celular en la terapia de reemplazo celular para la enfermedad de Parkinson. Las células madre tienen la habilidad de existir in vivo en un estado indiferenciado y de auto-renovarse. No están restringidas a tipos celulares específicos del tejido de origen, y por lo tanto son capaces de diferenciarse en respuesta a señales ambientales locales de otros tejidos. Esta capacidad de auto-renovación y diferenciación tiene un gran potencial terapéutico para curar enfermedades.

En la enfermedad de Parkinson la estrategia de reemplazo de células madre se basa en la ¡dea de que la restauración de la neurotransmisión de dopamina (DA) se efectúa por injertos celulares que se integran a lo largo del tiempo en el tejido restante y producen tejido funcional de larga duración. Existen dos métodos para tratar las células madre para los injertos en EP. En el primer método, antes del trasplante, las células se diferencian in-vitro a neuronas dopaminérgicas. Esto permite la estandarización y el control de calidad de las células relevantes. El segundo método comprende el trasplante de células madre no diferenciadas de las que se cree que se diferencian in-vivo a neuronas dopaminérgicas después de la implantación en el cuerpo estriado o la sustancia negra.

En teoría, las neuronas DA para terapia celular podrían crearse a partir de células madre de cuatro fuentes distintas: neuronas dopaminérgicas fetales, células madre neuronales, células madre embrionarias y células madre de médula

ósea.

La médula ósea contiene dos poblaciones principales de células madre: las células madre hematopoyéticas (CMH) y células madre mesenquimales (CMM) ocasionalmente citadas como células estromales de médula ósea.

Se mostró que las CEMO de rata después de la diferenciación expresan Tirosina-hidroxilasa (TH), colina acetiltransferasa y beta-lll tubulina [Woodbury, D., et al., J Neurosci Res. 69(6):98-17, 22]. El potencial clínico terapéutico de las CEMO murinas en EP se demostró mediante inyección intraestriatal de CEMO de ratón en el modelo murino para EP de 1-metil-4-phenil-1, 2, 3, 6-tetrahidropiridina (MPTP). Las células trasplantadas sobrevivieron y expresaron TH. Además se indicó una mejoría en el ensayo de la barra rotatoria 35 días después del trasplante [Li, Y., etai, Neurosci Lett. 316(2):67-7, 21],

La Solicitud de patente N° 2526598 les enseña a los presentes inventores CMM que sintetizan dopamina humana que expresan marcadores neuronales y factores de transcripción que caracterizan a las neuronas DA del mesencéfalo después de la inducción de la diferenciación neuronal.

Como una alternativa a una estrategia de reemplazo celular, donde las células injertadas tienen que sobrevivir y poseen propiedades morfológicas, electroflslológicas y funcionales dopaminérgicas, la terapia celular puede encaminarse a restaurar o restablecer la anatomía normal (conectividad) y fisiología (contactos sinópticos y funcionamiento apropiado) del cuerpo estriado.

Los factores Neurotróficos (NTF) son proteínas secretadas que regulan la supervivencia, el mantenimiento funcional y el desarrollo fenotípico de células neuronales. Las alteraciones en los niveles de los factores NTF están implicadas

en el desencadenamiento de la muerte celular programada en neuronas y por lo tanto contribuyen a la patogénesis de la enfermedad de Parkinson y otras enfermedades neurodegenerativas.

Uno de los NTF más potentes para las neuronas dopamlnérglcas se denomina factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF). Se sabe que este promueve la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra, promueve la extensión de neuritas, aumenta el tamaño del cuerpo celular y también eleva los niveles de TH. El GDNF pertenece a una familia de proteínas, relacionada con la superfamllla del TGF-p, que actualmente consiste en cuatro factores neurotróficos: GDNF, Neurturina (NTN), Perseflna, y Artemlna/Neublastlna. Se sabe que estos factores sirven como reguladores de proliferación y diferenciación celular

Un análisis de las células neuronales progenitores (ST14A) reveló que la sobreproducción del GDNF puede asociarse con una regulación positiva de los genes Implicados en el brote axonal, extensión de neuritas, formación de espinas, transporte de vesículas y plasticidad sinóptica [Pahnke J, et al., Exp Cell Res. 297(2):484-94, 24], También se sugirió que la actividad neuroprotectora del GDNF está mediada por la activación de sistemas de enzimas antloxldantes tales como la actividad de la glutatión peroxidasa, superóxido dlsmutasa y catalasa [Chao CC, Lee EH. Neuropharmacology, 38(6):913-6, 1999].

Diversos tipos celulares producen GDNF incluyendo las células gliales (oligodendrocitos y astrocitos), líneas celulares de neuroblastoma y de glioblastoma. Se ha demostrado recientemente que las CEMO de rata cultivadas en DMEM complementado con suero bovino fetal al 2 %, en el pase 6 expresan GDNF y NFG [Garda R, et al., Biochem Biophys Res Commun. 316(3):753-4, 24],

La síntesis de GDNF se puede regular por factores de crecimiento, hormonas, citocinas y neurotransmisores. Por ejemplo, el factor de necrosis tumoral-a o la interleucina 1 inducen la liberación de GDNF de las células de glioblastoma. La forskolina o el AMPc causan un aumento de la liberación de GNDF tanto por las líneas celulares de neuroblastoma como por las líneas celulares de glioblastoma. Estas células comprenden receptores de neurotransmisores, que permiten que los neurotransmisores regulen la producción de factores de crecimiento en condiciones de estrés.

Se ha demostrado que la administración de GDNF directamente en el cerebro es efectiva en diversos modelos animales de EP. Además, se ha probado que la exposición de las células a GDNF antes del trasplante es beneficiosa. Por ejemplo, injertar 4. neuronas dopaminérgicas fetales antes del trasplante aumentó significativamente la conducta rotacional de ratas lesionadas [Mehta V, et al., J Neurosurg. abril de 1999; 9(4):84-

6].

Se han usado diversos métodos para ayudar a la administración de GDNF en el cerebro incluyendo bombas osmóticas, cápsulas y microesferas. Otro enfoque para suministrar GDNF in vivo es la terapia génica. Las células mesenquimales de médula ósea genéticamente modificadas para expresar GDNF, trasplantadas a ratones lesionados con MPTP, fueron capaces de proteger neuronas de la sustancia negra así como fibras del cuerpo estriado [Park, K., Neurosci. Res. 4: 315-323, 21].

Varios estudios han mostrado que las células CMM después de la exposición a distintos factores in vitro, cambian su fenotipo y muestran marcadores neuronales y gliales [Kopen, G.C., et al., Proc Nati Acad EE.UU. 96(19): 1711-6, 1999; Sanchez-Ramos, et al. Exp Neurol. 164(2):247-56. 2; Woodbury, D., J Neurosci... [Seguir leyendo]

1. Un método para generar células similares a astrocitos, que comprende:

(a) incubar células madre mesenqulmales en un medio que comprende un factor de crecimiento epidérmico

humano (hEGF) y un factor de crecimiento básico de fibroblastos humano (hbFGF) para generar células predispuestas a generar células similares a astrocitos ; y

(b) incubar dichas células predispuestas en un medio de diferenciación que comprende un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y una neurregulina 1 -(31 humana, generando de este modo células similares a 1 astrocitos.

2. El método de la reivindicación 1, en el que una duración de dicha incubación en la etapa (b) es de aproximadamente 48 horas.

3. El método de la reivindicación 1, en el que una concentración de dicho PDGF es de aproximadamente 5 ng/ml.

4. El método de la reivindicación 1, en el que una concentración de dicha neurregulina 1-(31 humana es de aproximadamente 5 ng/ml.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicho medio de diferenciación comprende adicionalmente L-glutamina,

dibutiril AMPcíclico e isobutilmetilxantina IBMX.

6. El método de la reivindicación 1, en el que una concentración de hEGF es de aproximadamente 2 ng/ml.

7. El método de la reivindicación 1, en el que una concentración de hFGF es de aproximadamente 2 ng/ml.