Producción fermentativa de alcoholes de cuatro carbonos.

Una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de la coenzima B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2,

3-butanodiol en 2-butanona en la célula huésped en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana y en la que dicha célula huésped microbiana produce 2-butanona o 2-butanol, y adicionalmente en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 276 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO≥10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO≥0,1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.

Producción fermentativa de alcoholes de cuatro carbonos Campo de la invención La invención se refiere al campo de la microbiología industrial y la producción de alcoholes. Más específicamente, el 2-butanol se produce mediante fermentación industrial de un microorganismo recombinante. Los microorganismos recombinantes y procedimientos de la invención también pueden adaptarse para producir 2-butanona, un producto intermedio en las rutas biosintéticas de 2-butanol desveladas en el presente documento.

Antecedentes de la invención El butanol es un producto químico industrial importante útil como aditivo para combustible, como materia prima química en la industria de los plásticos y como un extrayente de calidad alimentaria en la industria alimentaria y de los aromas. Cada año se producen 10 a 12 billones de libras de butanol por medios petroquímicos y la necesidad de este producto químico probablemente aumentará. La 2-butanona, también denominada metiletilcetona (MEK) , es un disolvente ampliamente usado y es la cetona comercialmente producida más importante, después de la acetona. Se usa como disolvente para pinturas, resinas y adhesivos, además de un extrayente selectivo y activador de reacciones oxidativas.

Se conocen procedimientos para la síntesis química de la 2-butanona, tales como por deshidrogenación de 2butanol, o en un procedimiento en el que el butano líquido se oxida catalíticamente dando 2-butanona y ácido acético (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistr y , 6ª edición, 2003, Wiley-VCH Verlag GmbH y Co., Weinheim, Alemania, vol. 5, pág. 727-732) . La 2-butanona también puede convertirse químicamente en 2-butanol mediante hidrogenación (Breen y col., J. of Catalysis 236: 270-281 (2005) ) . Los procedimientos para la síntesis química de 2-butanol son conocidos, tales como hidratación de n-buteno (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistr y , 6ª edición, 2003, Wiley-VCH Verlag GmbH y Co., Weinheim, Alemania, vol. 5, pág. 716-719) . Estos procedimientos usan materiales de partida derivados de productos petroquímicos y generalmente son caros, y no son respetuosos con el medioambiente. La producción de 2-butanona y 2-butanol a partir de materiales de partida derivados de plantas minimizaría las emisiones de gases de efecto invernadero y representaría un avance en la materia.

También se conocen procedimientos para producir 2-butanol por biotransformación de otros productos químicos orgánicos. Por ejemplo, Stampfer y col. (documento WO 03/078615) describen la producción de alcoholes secundarios, tales como 2-butanol, por la reducción de cetonas que se catalizan por una enzima alcohol deshidrogenasa obtenida de Rhodococcus ruber. Similarmente, Kojima y col. (documento EP 0645453) describen un procedimiento de preparación de alcoholes secundarios, tales como 2-butanol, mediante reducción de cetonas que se cataliza por una enzima alcohol deshidrogenasa secundaria obtenida de Candida parapsilosis. Adicionalmente, Kuehnle y col. (documento EP 1149918) describen un procedimiento que produce tanto 1-butanol como 2-butanol por la oxidación de hidrocarburos por diversas cepas de Rhodococcus ruber. El procedimiento favoreció la producción de 1-butanol con una selectividad del 93, 8 %.

También se conoce la producción de 2-butanol por ciertas cepas de Lactobacilli (Speranza y col., J. Agric. Food Chem. (1997) 45:3476-3480) . El 2-butanol se produce por la transformación de meso-2, 3-butanodiol. También se demostró la producción de 2-butanol a partir de acetolactato y acetoína por estas cepas de Lactobacilli. Sin embargo, no hay informes de un microorganismo recombinante diseñado para producir 2-butanol.

Existe la necesidad, por tanto, de procedimientos rentables medioambientalmente responsables para la producción de 2-butanol y 2-butanona. La presente invención trata esta necesidad mediante el descubrimiento de huéspedes de producción microbiana recombinantes que expresan rutas biosintéticas de 2-butanol y 2-butanona.

Resumen de la invención La invención proporciona un microorganismo recombinante que tiene una ruta biosintética del 2-butanol manipulada. También se proporciona un microorganismo recombinante que tiene una ruta biosintética de la 2-butanona manipulada, que es la misma que la ruta biosintética del 2-butanol con omisión de la última etapa. Los microorganismos manipulados pueden usarse para la producción comercial de 2-butanol o 2-butanona. Por consiguiente, la invención proporciona una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza una conversión de sustrato en producto seleccionada del grupo que consiste en:

i) piruvato en alfa-acetolactato;

ii) alfa-acetolactato en acetoína;

iii) acetoína en 2, 3-butanodiol;

iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona; y

v) 2-butanona en 2-butanol;

en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana y en la que dicha célula huésped microbiana produce 2-butanol. En otra realización la invención proporciona una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza una conversión de sustrato en producto seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2, 3-butanodiol; y

iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona; en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana y en la que dicha célula huésped microbiana produce 2-butanona.

En otra realización la invención proporciona un procedimiento para la producción de 2-butanol que comprende: 1) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza una conversión de sustrato en producto seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato en acetoína, iii) acetoína en 2, 3-butanodiol; iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol;

en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y

2) poner en contacto la célula huésped de (1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en condiciones por las cuales se produce 2-butanol. Similarmente, la invención proporciona un procedimiento para la producción de 2-butanona que comprende: 1) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que

codifica un polipéptido que cataliza una conversión de sustrato en producto seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en alfa-acetolactato; ii) alfa-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2, 3-butanodiol; y iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona;

en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y

2) poner en contacto la célula huésped de (1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en condiciones por las cuales se produce 2-butanona. En otra realización la invención proporciona una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de la coenzima B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2, 3-butanodiol en 2-butanona en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana y en la que dicha célula huésped microbiana produce 2-butanona o 2butanol.

Además, la invención proporciona un procedimiento para la producción de 2-butanona que comprende: a) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2, 3butanodiol en 2-butanona y una fuente de 2, 3-butanodiol; en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y

b) cultivar la célula huésped microbiana de (a) en condiciones por las cuales la molécula de ácido nucleico aislada se expresa y el 2, 3-butanodiol se convierte en 2-butanona; y

c) opcionalmente recuperar la 2-butanona.

Además, la invención proporciona un procedimiento para la producción de 2-butanol que comprende:

a) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2, 3butanodiol en 2-butanona, actividad de butanol deshidrogenasa y una fuente de 2, 3-butanodiol;

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1. Una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de la coenzima B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2, 3butanodiol en 2-butanona en la célula huésped en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana y en la que dicha célula huésped microbiana produce 2-butanona o 2-butanol, y adicionalmente en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 276 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0, 1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.

2. La célula huésped microbiana recombinante según la reivindicación 1, en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 276.

3. La célula huésped microbiana recombinante según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende además una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa reactivasa independiente de B12.

4. La célula huésped microbiana recombinante según la reivindicación 3, en la que la reactivasa tiene una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 278 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0, 1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas.

5. La célula huésped microbiana recombinante según la reivindicación 3 o la reivindicaciones 4, en la que la reactivasa tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 278.

6. Un procedimiento para la producción de 2-butanona que comprende:

a) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2, 3butanodiol en 2-butanona en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 276 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0, 1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, y una fuente de 2, 3-butanodiol;

en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y

b) cultivar la célula huésped microbiana de (a) en condiciones por las cuales la molécula de ácido nucleico aislada se expresa y el 2, 3-butanodiol se convierte en 2-butanona; y

c) opcionalmente recuperar la 2-butanona.

7. Un procedimiento para la producción de 2-butanol que comprende:

a) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica una butanodiol deshidratasa independiente de B12 que cataliza la conversión de sustrato en producto de 2, 3butanodiol en 2-butanona en la que la butanodiol deshidratasa independiente de B12 tiene una secuencia de aminoácidos que tienen al menos el 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº : 276 basándose en el procedimiento Clustal W de alineamiento usando los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO=10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO=0, 1 y la serie Gonnet 250 de la matriz de pesos de proteínas, actividad de butanol deshidrogenasa y una fuente de 2, 3-butanodiol;

en la que la al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula huésped microbiana; y

b) cultivar la célula huésped microbiana de (a) en condiciones por las cuales la molécula de ácido nucleico aislada se expresa y el 2, 3-butanodiol se convierte en 2-butanona y la 2-butanona se convierte en 2-butanol; y

c) opcionalmente recuperar el 2-butanol.

8. La célula huésped microbiana recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende moléculas de ADN que codifican polipéptidos que catalizan la conversión de sustrato en productos:

i) piruvato en alfa-acetolactato;

ii) alfa-acetolactato en acetoína;

iii) acetoína en 2, 3-butanodiol;

iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol.

9. La célula huésped microbiana recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende moléculas de ADN que codifican polipéptidos que catalizan la conversión de sustrato en productos: i) piruvato en alfa-acetolactato; 5 ii) alfa-acetolactato en acetoína;

iii) acetoína en 2, 3-butanodiol; y iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona.

10. Uso de una célula huésped microbiana recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 8 ó 9 para la producción de 2-butanona o 2-butanol.