Producción fermentativa de alcoholes de cuatro carbonos.

Célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN heterólogo que codificanpolipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto:

i) piruvato en α-acetolactato;

ii) α-acetolactato en acetoína;

iii) acetoína en 2,3-butanodiol;

iv) 2,3-butanodiol en 2-butanona; y

v) 2-butanona en 2-butanol;

en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanol.

Producción fermentativa de alcoholes de cuatro carbonos Esta solicitud reclama la prioridad sobre 35 U.S.C. § 119 de la solicitud provisional de los EE.UU. de n.º de serie 60/796816, registrada el 2 de mayo de 2006, y la solicitud provisional de los EE.UU. de n.º de serie 60/871156, registrada el 21 de diciembre de 2006.

Campo de la invención La invención se refiere al ámbito de la microbiología industrial y de la producción de los alcoholes. Más específicamente, el 2-butanol se produce mediante la fermentación industrial de un microorganismo recombinante. Los microorganismos recombinantes y los procedimientos de la invención también pueden adaptarse para producir 2-butanona, un producto intermedio de las vías biosintéticas del 2-butanol descritas en la presente memoria.

Antecedentes de la invención El butanol es un compuesto químico industrial importante, útil como aditivo de combustibles, como compuesto químico que sirve de materia prima en la industria del plástico, y como disolvente de extracción con calidad alimentaria en la industria alimentaria y de los aromas. Cada año se producen de 10.000 a 12.000 millones de libras de butanol por medios petroquímicos y con toda probabilidad aumentará la necesidad el comercio de este compuesto químico. La 2-butanona, también denominada metiletilcetona (MEK) , es un disolvente ampliamente utilizado y es la cetona de producción comercial más importante, tras la acetona. Se utiliza como un disolvente para pinturas, resinas y adhesivos, y también como disolvente de extracción selectivo y activador de reacciones oxidativas.

Se conocen los procedimientos para la síntesis química de la 2-butanona, tales como la deshidrogenación del 2butanol, o en un procedimiento en el cual el butano líquido se oxida catalíticamente para dar 2-butanona y ácido acético («Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistr y », 6.ª edición, 2003, Wiley-VCHVerlag GmbH y Co., Weinheim, Alemania, vol. 5, págs. 727-732) . La 2-butanona también se puede convertir químicamente en 2-butanol mediante hidrogenación (Breen et al., J of Catalysts 236: 270-281 (2005) ) . Se conocen los procedimientos para la síntesis química del 2-butanol, tal como la hidratación del n-buteno («Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistr y », 6.ª edición, 2003, Wiley-VCHVerlag GmbH y Co., Weinheim, Alemania, vol. 5, págs. 716-719) . Estos procedimientos parten de materiales procedentes de sustancias petroquímicas y por lo general son caros, y no respetan el medio ambiente. La producción de 2-butanona y 2-butanol a partir de materiales brutos de origen vegetal disminuiría al mínimo las emisiones de efecto invernadero y representaría un avance en la técnica.

También se conocen procedimientos para producir 2-butanol mediante la biotransformación de otras sustancias orgánicas. Por ejemplo, Stampfer et al., (patente internacional WO 03/078615) describe la producción de alcoholes secundarios, tales como el 2-butanol, por la reducción de cetonas, lo que está catalizado por una enzima, la alcohol deshidrogenasa, obtenida de Rhodococcus ruber. De igual forma, Kojima et al. (patente europea EP 0645453) describen un procedimiento para preparar alcoholes secundarios, tales como el 2-butanol, mediante la reducción de cetonas catalizada por una enzima, la alcohol deshidrogenasa secundaria, obtenida de Candida parapsilosis. Adicionalmente, Kuehnle et al. (patente europea EP 1149918) describe un procedimiento que produce tanto 1butanol como 2-butanol mediante la oxidación de hidrocarburos con distintas cepas de Rhodococcus ruber. El procedimiento favoreció la producción de 1-butanol con una selectividad del 93, 8%.

También se conoce la producción de 2-butanol desde determinadas cepas de Lactobacillus (Speranza et al. J. Agric. Food Chem. (1997) 45: 3476-3480) . El 2-butanol se produce mediante la transformación del meso-2, 3-butanodiol. También se demostró que estas cepas de Lactobacillus producían el 2-butanol a partir de acetolactato y de acetoína. Sin embargo, no se ha descrito el diseño de un microorganismo recombinante que produzca el 2-butanol.

Por lo tanto, existe la necesidad de procedimientos rentables para la producción de 2-butanol y 2-butanona, y que sean responsables con el medio ambiente. La presente invención trata esta necesidad a través del descubrimiento de hospedadores recombinantes de origen microbiano que expresan las vías biosintéticas del 2-butanol y de la 2butanona.

Compendio de la invención La invención da a conocer un microorganismo recombinante que tiene una vía biosintética genomanipulada del 2butanol. También se da a conocer un microorganismo recombinante que tiene una vía biosintética de la 2-butanona genomanipulada, que es la misma que la vía biosintética del 2-butanol con omisión de la última etapa. Los microorganismos genomanipulados se pueden utilizar para la producción comercial del 2-butanol o de la 2-butanona.

De acuerdo con esto, la presente invención da a conocer una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN heterólogo que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto:

i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2, 3-butanodiol; iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol;

en dónde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanol. También se describe en la presente memoria una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de sustrato en producto seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2, 3-butanodiol; iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol;

en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula hospedadora microbiana y en donde dicha

célula hospedadora microbiana produce 2-butanol. En otra realización, la invención da a conocer una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN heterólogo que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto;

i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2, 3-butanodiol; y iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona;

en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanona. También se describe en la presente memoria una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de ADN que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de un sustrato en producto seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2, 3-butanodiol; y iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona;

en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula hospedadora microbiana y en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanona.

En otra realización, la invención da a conocer un procedimiento para la producción de 2-butanol que comprende: 1) proporcionar una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN heterólogo que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto:

i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2, 3-butanodiol; iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol;

en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanol; y

2) poner en contacto la célula hospedadora de 1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en las condiciones en las que se produce 2-butanol. También se describe en la presente memoria un procedimiento para la producción de 2-butanol que comprende: 1) proporcionar una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende al menos una molécula de

ADN que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de un sustrato a un producto seleccionada del grupo que consiste en: i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2, 3-butanodiol; iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona; y v) 2-butanona en 2-butanol;

en donde al menos una molécula de ADN es heteróloga a dicha célula hospedadora microbiana; y 2) poner en contacto la célula hospedadora de (1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en las condiciones en las que se produce 2-butanol.

En otra realización, la invención da a conocer un procedimiento para la producción de 2-butanona que comprende: 1) proporcionar una célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN

heterólogo que codifican polipéptidos que... [Seguir leyendo]

1. Célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN heterólogo que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto: i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2, 3-butanodiol; iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona; y

v) 2-butanona en 2-butanol; en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanol.

2. Célula hospedadora microbiana recombinante que comprende moléculas de ADN heterólogo que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato en producto: i) piruvato en a-acetolactato; ii) a-acetolactato en acetoína; iii) acetoína en 2, 3, butanodiol; y

iv) 2, 3-butanodiol en 2-butanona; en donde dicha célula hospedadora microbiana produce 2-butanona.

3. Célula hospedadora de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato en producto de: a) piruvato en a-acetolactato es la acetolactato sintasa; b) a-acetolactato en acetoína es la acetolactato descarboxilasa; c) acetoína en 2, 3-butanodiol es la butanodiol deshidrogenasa;

d) 2, 3-butanodiol en 2-butanona es la diol deshidratasa o glicerol deshidratasa; o e) 2-butanona en 2-butanol es la butanol deshidrogenasa.

4. Célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en: una bacteria, una cianobacteria, un hongo filamentoso y una levadura.

5. Célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la célula es un miembro del género seleccionado del grupo que consiste en Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Cor y nebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces.

6. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde:

a) la acetolactato sintasa tiene una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 4, SEQ ID n.º 77 y SEQ ID n.º 79 basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0, 1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas;

b) la acetolactato descarboxilasa tiene una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 2, SEQ ID n.º 81 y SEQ ID n.º 83 basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros pordefecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0, 1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas; o c) la butanodiol deshidrogenasa tiene una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 6, SEQ ID n.º 85, SEQ ID n.º 87 y SEQ ID n.º 89 basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0, 1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.

7. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprende subunidades mayores, medianas y menores de longitud completa que dan cada una un parámetro de valor de E de 0, 01 o menos cuando se consulta con un perfil de modelo oculto de Markov preparado con las subunidades mayores seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID n.º 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164; las subunidades medianas seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID n.º 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165; y las subunidades menores seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID n.º 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166; cada consulta se lleva a cabo con el algoritmo hmmsearch, en donde el parámetro Z está fijado a 1.000 millones.

8. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa se identifica mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

a) a) generación de un perfil de modelo oculto de Markov a partir del alineamiento de las secuencias aminoacídicas que corresponden a las subunidades mayores, medianas y menores de las enzimas diol y glicerol deshidratasas, en donde:

i) la subunidad mayor comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 8, 99, 105, 135, 138, 141, 146 y 164;

ii) la subunidad mediana comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 10, 101, 107, 136, 139, 142, 148 y 165; y

iii) la subunidad menor comprende una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 12, 103, 109, 137, 140, 143, 150 y 166;

b) con el perfil de modelo oculto de Markov de (a) se consulta al menos una base de datos pública de secuencias de proteínas que contiene secuencias de las diol y glicerol deshidratasas mediante el algoritmo hmmsearch, en donde el parámetro Z está fijado a 1.000 millones y el parámetro del valor de E está fijado a 0, 01, para identificar un primer conjunto de datos de secuencias aminoacídicas de diol y glicerol deshidratasas; y

c) eliminación de todas las secuencias parciales del primer conjunto de datos de (b) para generar un segundo conjunto de datos de secuencias aminoacídicas de diol y glicerol deshidratasas, en donde están identificadas las enzimas diol deshidratasa y glicerol deshidratasa.

9. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprende una subunidad mayor que comprende una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 8, 93, 99, 105, 135, 138, 141, 146, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 200, 203, 206, 209, 212, 215, 218, 221, 224, 227, 130, 243, 254, 255, 256, 257, 258 y 259, basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0, 1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.

Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprende una subunidad mediana que comprende una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 10, 95, 101, 107, 136, 139, 142, 148, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 244, 250, 252, 260, 261, 262, 263, 364, 265, 266 y 167 basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0, 1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.

11. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprende una subunidad menor que comprende una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 12, 97, 103, 109, 137, 140, 143, 150, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 199, 202, 205, 208, 211, 214, 217, 220, 223, 226, 229, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 245, 248, 249, 251, 253, 268, 270, 271, 272, 273 y 274, basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓNPOR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0, 1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.

12. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprende la fusión de subunidades mayores, medianas y menores que comprenden una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 233, 235, 237, 239, 241, 246 y 247, basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0, 1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.

13. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la diol deshidratasa o la glicerol deshidratasa comprende la fusión de subunidades mayores, medianas y menores y tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica que comprende las tres secuencias aminoacídicas que codifican las subunidades mayores, medianas y menores, seleccionadas del grupo que consiste en:

a) SEQ ID n.º 8, SEQ ID n.º 10 y SEQ ID n.º 12; b) SEQ ID n.º 93, SEQ ID n.º 95 y SEQ ID n.º 97; c) SEQ ID n.º 99, SEQ ID n.º 101 y SEQ ID n.º 103; d) SEQ ID n.º 105, SEQ ID n.º 107 y SEQ ID n.º 109; e) SEQ ID n.º 135, SEQ ID n.º 136 y SEQ ID n.º 137; f) SEQ ID n.º 138, SEQ ID n.º 139 y SEQ ID n.º 140; g) SEQ ID n.º 146, SEQ ID n.º 148 y SEQ ID n.º 150; h) SEQ ID n.º 141, SEQ ID n.º 142 y SEQ ID n.º 143; y i) SEQ ID n.º 164, SEQ ID n.º 165 y SEQ ID n.º 166;

basándose en el procedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓNPOR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DEL HUECO = 0, 1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.

14. Célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la butanol deshidrogenasa tiene una secuencia aminoacídica que tiene una identidad de al menos el 95% con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 14, SEQ ID n.º 72, SEQ ID n.º 75 y SEQ ID n.º 91 basándose en elprocedimiento de alineamiento Clustal W que utiliza los parámetros por defecto de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0, 1 y la serie Gonnet 250 como matriz de ponderación para proteínas.

15. Procedimiento para la producción de 2-butanol, que comprende:

1) proporcionar una célula hospedadora microbiana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 6 a 14; y

2) poner en contacto la célula hospedadora de 1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en las condiciones en las que se produce el 2-butanol.

16. Procedimiento para la producción de 2-butanona, que comprende:

1) proporcionar una célula hospedadora microbiana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 o 6 a 13; y

2) poner en contacto la célula hospedadora de 1) con un sustrato de carbono fermentable en un medio de fermentación en las condiciones en las que se produce la 2-butanona.

17. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 15 o 16, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en: una bacteria, una cianobacteria, un hongo filamentoso y una levadura.

18. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde la célula es un miembro de un género seleccionado del grupo que consiste en Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Cor y nebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces.

19. Medio de fermentación, que comprende: a) 2-butanol; y b) la célula hospedadora microbiana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a

14.

20. Medio de fermentación que comprende: a) 2-butanona; y b) la célula hospedadora microbiana recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.