Producción fermentativa de isobutanol utilizando enzimas cetol-ácido reductoisomerasas muy activas.

Un método para la conversión de acetolactato a dihidroxiisovalerato,

que comprende:

a) proporcionar una célula hospedante microbiana que comprende una construcción genética que codifica unpolipéptido que tienen una actividad específica de cetol-ácido reductoisomerasa mayor que la actividad específica deuna cetol-ácido reductoisomerasa de E. coli, en el que dicho polipéptido tiene una actividad específica de cetol-ácidoreductoisomerasa mayor que 1,1 μmoles/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo deconsumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones:

i) pH de aproximadamente 7,5;

ii) una temperatura de aproximadamente 22,5 ºC; y

iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM; y

b) poner en contacto la célula hospedante de a) con acetolactato, en el que se produce 2,3-dihidroxiisovalerato.

Producción fermentativa de isobutanol utilizando enzimas cetol-ácido reductoisomerasas muy activas Campo de la invención La invención se refiere al campo de la microbiología industrial y a la producción de alcoholes. De modo más específico, se produce isobutanol a través de la fermentación industrial de un microorganismo recombinante utilizando enzimas cetol-ácido reductoisomerasas (KARI) especiales con un número de recambio alto. Esta invención también se refiere a métodos para descubrir enzimas KARI muy activas a partir de microorganismos naturales.

Antecedentes de la invención El butanol es un importante producto químico, útil como aditivo de combustibles, como materia prima química en la industria del plástico, y como extractante de calidad alimentaria en la industria alimentaria y de aromatizantes. Cada año, de diez a doce mil millones de libras de butanol son producidas por medios petroquímicos, y es probable que aumente la necesidad de esta materia prima química.

Los métodos para la síntesis química del isobutanol son conocidos, tales como la síntesis oxo, la hidrogenación catalítica del monóxido de carbono (Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistr y , 6ª edición, 2003, Wiley-VCHVerlag GmbH and Co., Weinheim, Alemania, vol. 5, pp. 716-719) , y la condensación de Guerbet del metanol con n-propanol (Carlini et ál., J. Molec. Catal. A:Chem., 220, 215-220, 2004) . Estos procesos emplean materiales de partida derivados de petroquímicos y, en general, son caros y perjudiciales para el medioambiente. La producción de isobutanol a partir de materias primas derivadas de plantas podría minimizar las emisiones de gases causantes del efecto invernadero y representarán un avance en la técnica.

El isobutanol se produce de modo biológico como subproducto de la fermentación de levaduras. Es un componente del "aceite de fusel" que se forma como resultado del metabolismo incompleto de los aminoácidos por este grupo de hongos. El isobutanol se produce específicamente a partir del catabolismo de la L-valina. Después de que el grupo amina de la L-valina se haya recogido como fuente de nitrógeno, el a-cetoácido resultante es descarboxilado y reducido a isobutanol por enzimas de la denominada vía de Ehrlich (Dickinson et ál., J. Biol. Chem., 273, 2575225756, 1998) . Los rendimientos del aceite de fusel y/o sus componentes logrados durante la fermentación de bebidas generalmente son bajos. Por ejemplo, se ha indicado que la concentración de isobutanol producido en la fermentación de la cerveza es menor que 16 partes por millón (García et ál., Process Biochemistr y , 29, 303-309, 1994) . La adición de L-valina exógena a la fermentación aumenta el rendimiento de isobutanol, según describen Dickinson et ál., supra, en donde se indica que se obtiene un rendimiento de isobutanol de 3 g/l proporcionando Lvalina a una concentración de 20 g/l en la fermentación. Además, se ha demostrado la producción de n-propanol, isobutanol y alcohol isoamílico por células inmovilizadas por alginato de calcio de Zymomonas mobilis. Se empleó un medio que contenía glucosa al 10% suplementado con L-Leu, L-Ile, L-Val, ácido alfa-cetoisocaproico (alfa-KCA) , ácido alfa-cetobutírico (alfa-KBA) o ácido alfa-cetoisovalérico (alfa-KVA) (Oaxaca, et ál., Acta Biotechnol., 11, 523532, 1991) . El alfa-KCA aumenta los niveles de isobutanol. Los aminoácidos también producen los correspondientes alcoholes, pero en un grado menor que los cetoácidos. Se demostró un aumento en el rendimiento de alcoholes C3-C5 a partir de carbohidratos cuando se añaden los aminoácidos leucina, isoleucina y/o valina al medio de crecimiento como fuente de nitrógeno (documento WO 20055040392) .

Aunque los métodos descritos anteriormente indican el potencial de producción de isobutanol a través de medios biológicos, estos métodos tienen un coste prohibitivo a escala industrial para la producción de isobutanol. La biosíntesis de isobutanol directamente desde azúcares sería económicamente viable y representaría un avance en la técnica. Sin embargo, esta producción se ve gravemente obstaculizada por la lenta enzima cetol-ácido reductoisomerasa (KARI) , que cataliza la segunda etapa en la vía del isobutanol que convierte el acetolactato en dihidroxivalerato. Debido a que esta enzima ya se expresa a niveles altos (S. Epelbaum et ál., J. Bacteriol., 180, 4056-4067, 1998) , resulta necesario aumentar la actividad de KARI sin aumentar la cantidad de proteína, es decir, aumentar la actividad específica de la enzima.

Los solicitantes han resuelto el problema mencionado a través del descubrimiento de una enzima KARI que tiene una alta actividad específica que puede utilizarse para potenciar la producción biológica del isobutanol.

Resumen de la invención La invención se refiere a organismos recombinantes que expresan enzimas KARI muy activas. El microorganismo modificado tendrá niveles altos de la forma corta de la enzima KARI que posee una actividad específica significativamente mayor (6-8 veces mayor que la enzima KARI en E. coli) y puede utilizarse para la producción comercial de isobutanol. Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona un método para la conversión de acetolactato a dihidroxiisovalerato, que comprende:

a) proporcionar una célula hospedante microbiana que comprende una construcción genética que codifica un polipéptido que tiene una actividad específica de cetol-ácido reductoisomerasa mayor que la actividad específica de una cetol-ácido reductoisomerasa de E. coli; y b) poner en contacto la célula hospedante de a) con acetolactato, por lo que se produce 2, 3-dihidroxiisovalerato. En una realización preferida, la construcción genética codifica un polipéptido que tiene una actividad específica de

cetol-ácido reductoisomerasa mayor que 1, 1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones: a) pH de aproximadamente 7, 5; b) una temperatura de aproximadamente 22, 5 ºC; y c) potasio mayor que aproximadamente 10 mM.

En otra realización, la invención proporciona un método para la producción de isobutanol, que comprende: a) proporcionar una célula hospedante microbiana recombinante que comprende las siguientes construcciones genéticas:

1) al menos una construcción genética que codifica una enzima acetolactato sintasa para la conversión del piruvato

a acetolactato (etapa a de la vía) ; 2) al menos una construcción genética que codifica una enzima cetol-ácido reductoisomerasa con una actividad específica mayor que 1, 1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones:

i) pH de aproximadamente 7, 5; ii) una temperatura de aproximadamente 22, 5 ºC; y iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM, para la conversión de (S) -acetolactato a 2, 3-dihidroxiisovalerato

(etapa b de la vía) ;

3) al menos una construcción genética que codifica una acetohidroxiácido deshidratasa para la conversión de 2, 3dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato (etapa c de la vía) ; 4) al menos una construcción genética que codifica una cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa para la

conversión de a-cetoisovalerato a isobutiraldehído (etapa d de la vía) ;

5) al menos una construcción genética que codifica una alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa para la conversión de isobutiraldehído a isobutanol (etapa e de la vía) ; y b) cultivar la célula hospedante de a) bajo condiciones en las que se produce isobutanol. En otra realización, la invención proporciona una célula hospedante recombinante, que comprende una enzima

cetol-ácido reductoisomerasa que tiene una actividad específica mayor que la actividad específica de una cetol-ácido

reductoisomerasa de E. coli. En otra realización, la invención proporciona un método para la identificación y el aislamiento de una construcción genética, que codifica una enzima cetol-ácido reductoisomerasa que tiene una actividad específica mayor que 1, 1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones:

i) pH de aproximadamente 7, 5; ii) una temperatura de aproximadamente 22, 5 ºC; y iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM; que comprende las etapas de: a) identificar especies bacterianas que tengan un tiempo de duplicación más corto que E. coli cuando se cultivan en

medio mínimo M9;

b) seleccionar las especies bacterianas de (a) para la actividad cetol-ácido reductoisomerasa para identificar las especies bacterianas... [Seguir leyendo]

1. Un método para la conversión de acetolactato a dihidroxiisovalerato, que comprende: a) proporcionar una célula hospedante microbiana que comprende una construcción genética que codifica un polipéptido que tienen una actividad específica de cetol-ácido reductoisomerasa mayor que la actividad específica de una cetol-ácido reductoisomerasa de E. coli, en el que dicho polipéptido tiene una actividad específica de cetol-ácido

reductoisomerasa mayor que 1, 1 !moles/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo de consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones: i) pH de aproximadamente 7, 5; ii) una temperatura de aproximadamente 22, 5 ºC; y iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM; y b) poner en contacto la célula hospedante de a) con acetolactato, en el que se produce 2, 3-dihidroxiisovalerato. 2. Un método para la producción de isobutanol, que comprende: a) proporcionar una célula hospedante microbiana que comprende las siguientes construcciones genéticas: 1) al menos una construcción genética que codifica una enzima acetolactato sintasa para la conversión del piruvato

a acetolactato; 2) al menos una construcción genética que codifica una enzima cetol-ácido reductoisomerasa que tiene una

actividad específica mayor que 1, 1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones: i) pH de aproximadamente 7, 5; ii) una temperatura de aproximadamente 22, 5 ºC; y iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM, para la conversión de (S) -acetolactato a 2, 3-dihidroxiisovalerato; 3) al menos una construcción genética que codifica una acetohidroxiácido deshidratasa para la conversión de 2, 3

dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato;

4) al menos una construcción genética que codifica una cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa para la conversión de a-cetoisovalerato a isobutiraldehído; 5) al menos una construcción genética que codifica una alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa para la

conversión de isobutiraldehído a isobutanol; y b) cultivar la célula hospedante de a) bajo condiciones en las que se produce isobutanol. 3. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que al menos una construcción genética que

codifica un polipéptido que tiene actividad cetol-ácido reductoisomerasa se aisla de Pseudomonas. 4. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido que tiene actividad cetol-ácido

reductoisomerasa se aisla de Pseudomonas aeruginosa (PAO1) , Pseudomonas fluorescens (PF5) , o Vibrio cholerae (N16961) . 5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la célula hospedante es un miembro de un

género seleccionado del grupo que consiste en Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Cor y nebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula, Vibrio y Saccharomyces.

6. El método según la reivindicación 5, en el que la célula hospedante es Escherichia coli, Lactobacillus plantarum,

o Saccharomyces cerevisiae.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que la acetolactato sintasa tiene una secuencia de aminoácidos según se indica en SEQ ID NO:2.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el polipéptido que tiene actividad cetolácido reductoisomerasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 y SEQ ID NO:36.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-8, en el que la actividad cetohidroxiácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácidos según se indica en SEQ ID NO:6.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en el que la alcohol de cadena ramificada deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos según se indica en SEQ ID NO:10.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en el que la a-cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa tiene una secuencia de aminoácidos según se indica en SEQ ID NO:8.

12. Una célula hospedante recombinante que comprende una construcción genética que codifica una enzima cetolácido reductoisomerasa que tiene una actividad específica mayor que la actividad específica de una cetol-ácido reductoisomerasa de E. coli, en la que la enzima cetol-ácido reductoisomerasa que tiene una actividad específica mayor que la actividad específica de una cetol-ácido reductoisomerasa de E. coli tiene una actividad específica mayor que 1, 1 !moles/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo de consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones:

a) pH de aproximadamente 7, 5;

b) una temperatura de aproximadamente 22, 5 ºC; y

c) potasio mayor que aproximadamente 10 mM.

13. Un método para la identificación y el aislamiento de una construcción genética, que codifica una enzima cetolácido reductoisomerasa que tiene una actividad específica mayor que 1, 1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones:

i) pH de aproximadamente 7, 5;

ii) una temperatura de aproximadamente 22, 5 ºC; y

iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM;

que comprende las etapas de:

a) identificar especies bacterianas que tengan un tiempo de duplicación más corto que E. coli cuando se cultivam en medio mínimo M9;

b) seleccionar las especies bacterianas de (a) para la actividad cetol-ácido reductoisomerasa para identificar las especies bacterianas activas;

c) sondar el ADN genómico de las especies bacterianas activas de b) con secuencias de ácidos nucleicos que tengan homología con construcciones genéticas conocidas por codificar una cetol-ácido reductoisomerasa, para identificar y aislar las construcciones genéticas que codifican una cetol-ácido reductoisomerasa a partir de dichas especies bacterianas activas; y

d) amplificar y expresar las construcciones genéticas que codifican una cetol-ácido reductoisomerasa a partir de dichas especies bacterianas activas; y

e) seleccionar las construcciones genéticas expresadas de la etapa d) para detectar las que tengan una actividad específica mayor que 1, 1 !mol/min/mg basada en la proteína purificada, medida mediante el ensayo del consumo de NADPH, ejecutado bajo las siguientes condiciones:

i) pH de aproximadamente 7, 5;

ii) una temperatura de aproximadamente 22, 5 ºC; y

iii) potasio mayor que aproximadamente 10 mM.

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicha especie bacteriana activa se selecciona del grupo que consiste en Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Vibrio, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Cor y nebacterium, y Brevibacterium.

15. El método según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que el tiempo de duplicación de la etapa a) es igual o menor que 80% del tiempo de duplicacion de E. coli cuando se cultiva en medio mínimo M9.