Procedimiento para producir isobutanol.

Un método para la producción de isobutanol, que comprende:

a) proveer un huésped de producción microbiano recombinante que produce isobutanol,

en el que dicho huésped microbiano recombinante comprende moléculas de ADN que codifican polipéptidos que catalizan cada uno de los siguientes sustratos de manera de producir conversiones:

i) piruvato a acetolactato;

ii) acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato;

iii) 2,3-dihidroxiisovalerato a un α-cetoisovalerato;

iv) α-cetoisovalerato a isobutiraldehído, y

v) isobutiraldehído a isobutanol;

en el que al menos una de dichas moléculas de ADN es heteróloga con respecto a dicho huésped microbiano recombinante;

b) sembrar el huésped de producción de (a) en un medio de fermentación que comprende un sustrato de carbono fermentable para crear un cultivo de fermentación;

c) cultivar el huésped de producción en el cultivo de fermentación a una primera temperatura durante un primer periodo de tiempo, en el que la primera temperatura es de aproximadamente 25 ºC a aproximadamente 40°C;

d) reducir la temperatura del cultivo de fermentación a una segunda temperatura; y

e) incubar el huésped de producción a la segunda temperatura de la etapa (d) durante un segundo período de tiempo; con lo cual se produce isobutanol

Procedimiento para producir isobutanol.

Campo de la invención La invención se refiere a un método para la producción de isobutanol mediante fermentación, para lo cual se utiliza un huésped microbiano recombinante. Específicamente, el método emplea una disminución en la temperatura durante la fermentación, lo que tiene como resultado una tolerancia más robusta del huésped de producción con respecto al producto isobutanol.

Antecedentes de la invención El butanol es un producto químico industrial importante, útil como aditivo para combustibles, como un producto químico de alimentación en la industria de los materiales plásticos, y como un agente de extracción compatible con productos alimenticios en la industria alimenticia y saborizantes. Todos los años se producen de 10 a 12 mil millones libras de butanol mediante medios petroquímicos, y es probable que aumente la necesidad de este producto químico.

Se conocen métodos para la síntesis química del isobutanol, tales como la oxosíntesis, la hidrogenación catalítica de monóxido de carbono (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistr y , 6th edition, 2003, Wiley-VCH Verlag GmbH and Co., Weinheim, Alemania, Vol. 5, pp. 716-719) y Guerbet Condensation of methanol with n-propanol (Carlini et al., J. Mol. Catal. A.: Chem. 220:215-220- (2004) ) . En estos procesos se utilizan materiales de partida derivados de productos petroquímicos y son, por lo general, costosos y no compatibles con el medio ambiente. La producción de isobutanol a partir de materias primas derivadas de plantas minimizaría las emisiones de gas de efecto invernadero y representarían un avance en la técnica.

El isobutanol se produce biológicamente como un subproducto de la fermentación de la levadura. Es un componente de “líquido que contiene alcohol amílico” que se forma como resultado del metabolismo incompleto de los aminoácidos de este grupo de hongos. El isobutanol se produce específicamente a partir del catabolismo de Lvalina. Después de haberse cosechado el grupo amina de L-valina como una fuente de nitrógeno, el α-cetoácido resultante se descarboxila y se reduce a isobutanol por las enzimas de la denominada vía de Ehrlich (Dickinson et al., J. Biol. Chem. 273 (40) : 25752-25756 (1998) ) . Los rendimientos del líquido que contiene alcohol amílico y/o de componentes logrados durante la fermentación de bebidas son típicamente bajos. Por ejemplo, se informa que la concentración de isobutanol producido en la fermentación de cerveza es de menos de 16 partes por millón (García et al., Process Biochemistr y , 29:303-309 (1994) ) . La adición de L-valina exógena a la fermentación aumenta el rendimiento de isobutanol, como se describe en Dickinson et al., supra, en el que se informa que se obtiene un rendimiento de isobutanol de 3 g/L mediante la provisión de L-valina con una concentración de 20 g/L en la fermentación. Sin embargo, el uso de valina como una materia prima de alimentación sería de un costo prohibitivo para la producción de isobutanol en escala industrial. Jansen et al. informan acerca del uso de un enfoque de cribado o selección sistemática de alta productividad en placas de microtitulación para estudiar los efectos de la concentración de pH, la temperatura y la concentración de sal sobre el desarrollo de Z. rouxii y la formación de alcoholes amílicos a partir de aminoácidos de cadena ramificada (FEMS Yeast Research, 3, (2003) , 313-318) . La biosíntesis de isobutanol directamente a partir de azúcares sería económicamente viable y representaría un avance en la técnica.

Se han descrito huéspedes de producción microbianos recombinantes que expresan una vía de biosíntesis de isobutanol (Donaldson et al., Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. N° 20070092957 A1, copendiente y de propiedad común) . Sin embargo, se cree que la producción biológica de isobutanol está limitada por la toxicidad del butanol con respecto al microorganismo huésped utilizado en la fermentación.

En la técnica se conocen algunas cepas microbianas que son tolerantes al isobutanol (Bramucci et al, Solicitud de Patente copendiente y de propiedad común Nos 11/743220 (US 2007259411) . El documento US 2007/0092957 A1 revela en especial un método para producir isobutanol, que comprende:

a) proveer un huésped de producción microbiano recombinante que produce isobutanol, en donde dicho huésped microbiano recombinante comprende moléculas de ADN que codifican polipéptidos que catalizan cada uno de los sustratos siguientes de manera de producir conversiones:

i) piruvato a acetolactato;

ii) acetolactato a 2, 3-dihidroxiisovalerato iii) 2, 3-dihidroxiisovalerato a alfa-cetoisovalerato ív) α-cetoisovalerato a isobutiraldehído; y

v) isobutiraldehído a isobutanol, en donde por lo menos una molécula de ADN es heteróloga con respecto a dicho huésped de producción microbiano;

b) sembrar el huésped de producción de a) en un medio de fermentación que comprende un sustrato de carbono fermentable a efectos de crear un cultivo de fermentación;

c) incubar dicho huésped de producción a la temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, con lo que se produce isobutanol.

Sin embargo, para una producción comercial que seda efectiva desde el punto de vista de los costos, se requieren métodos biológicos para la producción de isobutanol a niveles más elevados.

Ha habido informes que describen el efecto de la temperatura sobre la tolerancia de algunas cepas microbianas frente al etanol. Por ejemplo, Amartey et al. (Biotechnol. Lett. 13 (9) :627-632 (1991) ) describen que el Bacillus stearothermophillus es menos tolerante al etanol a 70°C que a 60°C. Herrero et al. (Apps. Environ. Microbiol. 40 (3) :571-577 (1980) ) informan que la temperatura óptima de crecimiento de una cepa de tipo salvaje de Clostridium thermocellum disminuye a medida que aumenta la concentración del etanol de la exposición, mientras que la temperatura óptima de crecimiento de un mutante tolerante al etanol permanece constante. Brown et al. (Biotechnol. Lett. 4 (4) :269-274 (1982) ) revelan que la levadura Saccharomyces uvarum es más resistente a la inhibición del crecimiento por etanol a temperaturas de 5°C y 10°C por debajo de su óptimo de crecimiento de 35°C. Sin embargo, la fermentación se hizo más resistente a la inhibición de etanol al aumentar la temperatura. Además, Van Uden (CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1 (3) :263-273 (1984) ) informan que el etanol y otros alcanoles deprimen la temperatura de crecimiento máxima y óptima para el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae mientras se acentúa la muerte térmica. Más aún, Lewis et al. (Publicación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. N° 2004/0234649) describen métodos para producir elevados niveles de etanol durante la fermentación de material vegetal que comprenden disminuir la temperatura durante la sacarificación, fermentación, o sacarificación y fermentación simultáneas.

Mucho menos se conoce sobre el efecto de la temperatura sobre la tolerancia de las cepas microbianas a los butanoles. Harada (Hakko Kyokaishi 20:155-156 (1962) ) revela que el rendimiento de 1-butanol en acetonobutanoletanol (ABE) de fermentación aumenta de 18, 4%-18, 7% a 19, 1%-21, 2% mediante la disminución de la temperatura de 30°C a 28°C cuando el crecimiento de las bacterias alcanza un máximo. Jones et al. (Microbiol. Rev. 15 50 (4) :484-524 (1986) ) revisa el papel de la temperatura en la fermentación de ABE. Ellos informan que los rendimientos de solventes de tres diferentes cepas productoras de solvente permanecen bastante constantes en 31% a 30°C y 33°C, pero disminuyen a 23 a 25% a 37°C. Resultados similares fueron informados para Clostridium acetobutylicum para el que los rendimientos de solvente disminuyeron de 29% a 25 C a 24% a 40°C. En este último caso, la disminución del rendimiento de solvente se atribuyó a una disminución en la producción de acetona mientras que el rendimiento de 1-butanol no se vio afectado. Sin embargo, Carnarius (Patente de EE.UU. N º 2.198.104) informa que se obtiene un aumento en la relación de butanol en el proceso de ABE mediante la disminución de la temperatura de la fermentación de 30°C a 24°C después de 16 horas. Sin embargo, el efecto de la temperatura sobre la producción de isobutanol por los huéspedes microbianos recombinantes no se conoce en la técnica.

Por lo tanto, hay una necesidad de un proceso efectivo desde el punto de vista de los costos, para la producción de isobutanol por fermentación que provea rendimientos mayores que los procesos conocidos en la técnica. La presente invención aborda esta necesidad mediante el descubrimiento de un método para producir... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción de isobutanol, que comprende:

a) proveer un huésped de producción microbiano recombinante que produce isobutanol, en el que dicho huésped microbiano recombinante comprende moléculas de ADN que codifican polipéptidos que catalizan cada uno de los siguientes sustratos de manera de producir conversiones:

i) piruvato a acetolactato;

ii) acetolactato a 2, 3-dihidroxiisovalerato;

iii) 2, 3-dihidroxiisovalerato a un α-cetoisovalerato;

iv) α-cetoisovalerato a isobutiraldehído, y

v) isobutiraldehído a isobutanol;

en el que al menos una de dichas moléculas de ADN es heteróloga con respecto a dicho huésped microbiano recombinante;

b) sembrar el huésped de producción de (a) en un medio de fermentación que comprende un sustrato de carbono fermentable para crear un cultivo de fermentación;

c) cultivar el huésped de producción en el cultivo de fermentación a una primera temperatura durante un primer periodo de tiempo, en el que la primera temperatura es de aproximadamente 25 ºC a aproximadamente 40°C;

d) reducir la temperatura del cultivo de fermentación a una segunda temperatura; y

e) incubar el huésped de producción a la segunda temperatura de la etapa (d) durante un segundo período de tiempo;

con lo cual se produce isobutanol.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sustrato de carbono fermentable se deriva de una fuente de granos o de azúcar seleccionado en el grupo que consiste en trigo, maíz, cebada, avena, centeno, caña de azúcar, remolacha azucarera, mandioca, sorgo dulce, y sus mezclas.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sustrato de carbono fermentable se deriva de biomasa celulósica o lignocelulósica seleccionada en el grupo que consiste en mazorcas de maíz, residuos de cosechas, chala de maíz, rastrojo de maíz, gramíneas, paja de trigo, paja de cebada, heno, paja de arroz, césped de pradera, residuos de papel, bagazo de caña, sorgo, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, virutas de madera, aserrín, arbustos y matas, de verduras, frutas, flores, estiércol de animales, y sus mezclas.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sustrato de carbono fermentable se selecciona en el grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el cultivo de fermentación se mantiene bajo condiciones seleccionadas en el grupo que consiste en condiciones anaerobias y condiciones microaerobias.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde mientras se cultiva el huésped de producción en (c) a una primera temperatura durante un primer período de tiempo, se supervisa un parámetro metabólico del cultivo de fermentación.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el parámetro metabólico que se supervisa se selecciona en el grupo que consiste en: densidad óptica, pH, cociente respiratorio, utilización del sustrato de carbono fermentable, producción de CO2, y producción de isobutanol.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la reducción de la temperatura del cultivo de fermentación de la etapa (d) se produce en un momento predeterminado.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la reducción de la temperatura del cultivo de fermentación de la etapa (d) coincide con un cambio en el parámetro metabólico.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el cambio en el parámetro metabólico es una disminución en el coeficiente de producción de isobutanol.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la segunda temperatura es de aproximadamente 3 ºC a aproximadamente 25 ºC más baja que la primera temperatura.

12.El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11, en donde las etapas (d) y (e) se repiten una o más veces.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el huésped de producción microbiano recombinante se selecciona entre el grupo que consiste en: Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonela, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiela, Paenibacillus, Arthrobacter, Cor y nebacterium, Brevibacterium, Saccharomyces y Pichia.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el polipéptido que cataliza un sustrato para producir la conversión de piruvato en acetolactato es acetolactato sintasa y la acetolactato sintasa tiene una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de al menos 95% con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 178 y SEQ ID NO: 180, basado en el método Clustal W de alineación en el que se utilizan los parámetros por defecto GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 0, 1, y la serie Gonnet 250 de matriz de peso de proteína; o

en donde el polipéptido que cataliza un sustrato para producir la conversión de acetolactato a 2, 3dihidroxiisovalerato es acetohidroxi ácido isomerorreductasa y la acetohidroxi ácido isomerorreductasa tiene una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de al menos 95% con una secuencia de aminoácido seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 185, basado en el método Clustal W de alineación en el que se utilizan los parámetros por defecto GAP PENALTY = 10, GAP LENGHT PENALTY = 0, 1, y la serie Gonnet 250 de matriz de peso de proteína; o en donde el polipéptido que cataliza un sustrato para la producir la conversión de 2, 3-dihidroxiisovalerato en αcetoisovalerato es acetohidroxi ácido deshidratasa y la acetohidroxi ácido deshidratasa tiene una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de al menos 95% con una secuencia de aminoácido seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 188 y SEQ ID NO: 190, basado en el método Clustal W de alineación en el que se utilizan los parámetros por defecto GAP PENALTY = 10, GAP LENGHT PENALTY = 0, 1, y la serie Gonnet 250 de matriz de peso de proteína; o en donde el polipéptido que cataliza un sustrato para producir la conversión de α-cetoisovalerato en isobutirilaldehído es α-ceto ácido descarboxilasa de cadena ramificada y la α-ceto ácido descarboxilasa de cadena ramificada de cadena ramificada tiene una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de al menos 95% con una secuencia de aminoácido seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 1993, SEQ ID NO: 195 y SEQ ID NO: 197, basado en el método Clustal W de alineación en el que se utilizan los parámetros por defecto GAP PENALTY = 10, GAP LENGHT PENALTY = 0, 1, y la serie Gonnet 250 de matriz de peso de proteína; o en donde el polipéptido que cataliza un sustrato para producir la conversión de isobutiraldehído en isobutanol es alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada y la alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada tiene una secuencia de aminoácido que tiene una identidad de al menos 95% con una secuencia de aminoácido seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 203, y SEQ ID NO: 204, basado en el método Clustal W de alineación en el que se utilizan los parámetros por defecto GAP PENALTY = 10, GAP LENGHT PENALTY = 0, 1, y la serie Gonnet 250 de matriz de peso de proteína.

Figura 1