Identificación y uso de [2Fe-2S]-dihidroxi-ácido deshidratasas bacterianas.

Un método de identificación de enzimas [2Fe-2S] DHAD que comprende:

a) consultar una o más secuencias de aminoácidos con un perfil modelo oculto de Markov preparado usando las proteínas de SEC ID Nº: 164, 168, 230, 232, 298, 310, 344 y 346, en el que una coincidencia con un valor de E inferior a 10-5 proporciona un primer subconjunto de secuencias, por el cual dicho primer subconjunto de secuencias se corresponde con una o más proteínas relacionadas con DHAD;

b) analizar el primer subconjunto de secuencias que se corresponde con una o más proteínas relacionadas con DHAD de la etapa (a) para la presencia de tres cisteínas conservadas que se corresponden con las posiciones 56, 129 y 201 en la secuencia de aminoácidos de dihidroxi-ácido deshidratasa de Streptococcus mutans (SEC ID Nº: 168), por el cual se identifican un segundo subconjunto de secuencias que codifican enzimas [2Fe-2S] DHAD; y c) analizar el segundo subconjunto de secuencias de la etapa (b) para la presencia de aminoácidos conservados distintivos en las posiciones correspondientes a las posiciones en la secuencia de aminoácidos de DHAD de Streptococcus mutans (SEC ID Nº: 168) que son ácido aspártico en la posición 88, arginina o asparagina en la posición 142, asparagina en la posición 208 y leucina en la posición 454, por el cual se identifican adicionalmente un tercer subconjunto de secuencias que codifica enzimas [2Fe-2S] DHAD.

Identificación y uso de [2Fe-2S]-dihidroxi-ácido deshidratasas bacterianas Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud está relacionada con y reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. n° 61/1.792 presentada el 29 de septiembre de 28.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la microbiología industrial y la expresión de actividad de dihidroxi-ácido deshidratasa. Más específicamente, las dihidroxi-ácido deshidratasas bacterianas con un conglomerado de [2Fe-2S] se identifican y expresan como proteínas heterólogas en huéspedes bacterianos y de levadura.

Antecedentes de la invención

La dihidroxi-ácido deshidratasa (DHAD), denominada también acetohidroxi-ácido deshidratasa, cataliza la conversión de 2,3-dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato y de 2,3-dihidroximetilvalerato en a-cetometilvalerato. La enzima DHAD, clasificada como E.C. 4.2.1.9, es parte de las rutas biosintéticas que se producen naturalmente que producen valina, isoleucina, leucina y ácido pantoténico (vitamina B5). Se desea elevada expresión de la actividad de DHAD para la potenciada producción microbiana de aminoácidos de cadena ramificada o de ácido pantoténico.

La conversión catalizada por DHAD de 2,3-dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato también es una etapa común en las múltiples rutas biosintéticas de isobutanol que se desvelan en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. del mismo solicitante y en tramitación junto con la presente US 2792957 A1. En el presente documento se desvela la manipulación de microorganismos recombinantes para la producción de isobutanol. El isobutanol es útil como aditivo para combustible, cuya disponibilidad puede reducir la demanda de combustibles petroquímicos.

Para la producción mejorada de compuestos sintetizados en rutas que incluyen dihidroxi-ácido deshidratasa, se desea expresar una enzima heteróloga que proporciona esta actividad enzimática en la producción portadora de interés. La obtención de alta expresión funcional de dihidroxi-ácido deshidratasas en un huésped heterólogo se complica por el requisito de la enzima de un conglomerado de Fe-S, que implica la disponibilidad y carga adecuada del conglomerado en la apo-proteína DHAD.

Las enzimas DHAD que requieren el conglomerado Fe-S se conocen en la técnica y se encuentran tanto en la forma [4Fe-4S] como [2Fe-2S], Se conocen algunas enzimas bacterianas, siendo la mejor caracterizada E. cotí (Flint, DH y col. (1993) J. Biol. Chem. 268:14732-14742). Sin embargo estas enzimas bacterianas están todas en la forma [4Fe- 4S], La única forma de [2Fe-2S] informada hasta la fecha es una enzima de espinaca (Flint y Emptage (1988) J. Biol. Chem. 263:3558-3564).

Se desea usar la forma [2Fe-2S] de la enzima en células huésped para potenciar la producción de rutas biosintéticas introducidas ya que la forma [2Fe-2S] crea una menor carga sobre la síntesis y/o ensamblaje del conglomerado Fe- S. Desafortunadamente, solo se conoce una forma [2Fe-2S] de esta enzima.

Por tanto, existe una necesidad de identificar nuevas formas de [2Fe-2S] de DHAD para su uso en células huésped recombinantes en las que la conversión de 2,3-dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato es una etapa de ruta metabólica en una ruta biosintética deseada.

Compendio de la invención

En el presente documento se proporciona un método de identificación de enzimas [2Fe-2S] DHAD, comprendiendo dicho método:

a) consultar una o más secuencias de aminoácidos con un perfil modelo oculto de Markov preparado usando las proteínas de SEC ID N°: 164, 168, 23, 232, 298, 31, 344 y 346, en el que una coincidencia con un valor de E inferior a 1'5 proporciona un primer subconjunto de secuencias, por el cual dicho primer subconjunto de secuencias se corresponde con una o más proteínas relacionadas con DHAD;

b) analizar el primer subconjunto de secuencias que se corresponde con una o más proteínas relacionadas con DHAD de la etapa (a) para la presencia de tres cisteínas conservadas que se corresponden con las posiciones 56, 129 y 21 en la secuencia de aminoácidos de dihidroxi-ácido deshidratasa de Streptococcus mutans (SEC ID N°: 168), por el cual se identifican un segundo subconjunto de secuencias que codifica enzimas [2Fe-2S] DHAD; y

c) analizar dicho segundo subconjunto de secuencias de la etapa (b) para la presencia de aminoácidos conservados distintivos en las posiciones correspondientes a posiciones en la secuencia de aminoácidos de DHAD de Streptococcus mutans (SEC ID N°: 168) que son ácido aspártico en la posición 88, arginina o asparagina en la posición 142, asparagina en la posición 28 y leucina en la posición 454, por el cual se identifican adicionalmente un tercer subconjunto de secuencias que codifica enzimas [2Fe-2S] DHAD.

En otro aspecto de la invención, el método anterior comprende además:

d) expresar un polipéptido que tiene una secuencia identificable por una cualquiera o todas de las etapas a), b) y c) en una célula; y

e) confirmar que dicho polipéptido tiene actividad de DHAD en la célula.

En otro aspecto de la invención, el método anterior comprende además:

d) purificar una proteína codificada por una secuencia identificable por una cualquiera o todas de las etapas a), b) y

c); y

e) confirmar que dicha proteína es una enzima [2Fe-2S] DHAD por espectroscopia UV-vis y EPR.

En otro aspecto de la invención, el método anterior comprende además seleccionar una o más secuencias 1 correspondientes a secuencias de la enzima [2Fe-2S] DHAD bacteriana identificadas en una cualquiera o todas de las etapas a), b) y c). Dichas secuencias seleccionadas pueden expresarse en una célula; y la actividad de DHAD en la célula puede confirmarse. Dichas secuencias seleccionadas pueden purificarse adicionalmente de forma que se obtenga una proteína purificada y la actividad de la enzima [2Fe-2S] DHAD de dicha proteína purificada puede confirmarse por espectroscopia UV-vis y EPR.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula huésped microbiana que comprende al menos una enzima [2Fe- 2S] DHAD heteróloga identificable por los métodos descritos en el presente documento en la que dicha enzima [2Fe- 2S] DHAD heteróloga no es una enzima de espinaca. Dicha célula puede ser una célula bacteriana o una célula de levadura. La célula también puede ser una célula recombinante que produce isobutanol. Realizaciones de la célula huésped microbiana son como se definen en las reivindicaciones. En particular, en una realización, dicha enzima 2 [2Fe-2S] DHAD heteróloga comprende:

(a) una secuencia de aminoácidos que coincide con un perfil modelo oculto de Markov preparado usando las proteínas de SEC ID N°: 164, 168, 23, 232, 298, 31, 344 y 346, con un valor de E inferior a 1"5;

(b) tres cisteínas conservadas que se corresponden con las posiciones 56, 129 y 21 en la secuencia de aminoácidos de dihidroxi-ácido deshidratasa de Streptococcus mutans (SEC ID N°: 168); y

(c) aminoácidos conservados distintivos en las posiciones correspondientes a las posiciones en la secuencia de

aminoácidos de DHAD de Streptococcus mutans (SEC ID N°: 168) que son ácido aspártico en la posición 88, arginina o asparagina en la posición 142, asparagina en la posición 28 y leucina en la posición 454. En otra realización, dicha célula carece de actividad de DHAD endógena. En otra realización, la DHAD heteróloga es una DHAD bacteriana. En otra realización, la DHAD heteróloga se deriva de Streptococcus mutans o Lactococcus lactis. 3 En otra realización, la enzima [2Fe-2S] DHAD heteróloga tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 168 o SEC ID N°: 232 o una secuencia con al menos el 85 % de identidad o al menos el 95 % de identidad con la misma. En otra realización, dicha célula es una célula bacteriana, preferentemente un miembro de un género de bacterias seleccionado del grupo que consiste en Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, 35 Arthrobacter, Corynebacterium, y Brevibacterium, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus y Streptococcus, o una célula de levadura, preferentemente un miembro de un género de levadura seleccionado del grupo que consiste en Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia y Pichia, más preferentemente Saccharomyces cerevisiae. En otra realización, dicha célula huésped comprende una ruta biosintética de isobutanol, preferentemente la ruta biosintética de isobutanol comprende las siguientes 4 conversiones de sustrato en producto:

1. Un método de identificación de enzimas [2Fe-2S] DHAD que comprende:

a) consultar una o más secuencias de aminoácidos con un perfil modelo oculto de Markov preparado usando las proteínas de SEC ID N°: 164, 168, 23, 232, 298, 31, 344 y 346, en el que una coincidencia con un valor de E Inferior a 1'5 proporciona un primer subconjunto de secuencias, por el cual dicho primer subconjunto de secuencias se corresponde con una o más proteínas relacionadas con DHAD;

b) analizar el primer subconjunto de secuencias que se corresponde con una o más proteínas relacionadas con DHAD de la etapa (a) para la presencia de tres cisternas conservadas que se corresponden con las posiciones 56, 129 y 21 en la secuencia de aminoácidos de dihidroxi-ácido deshldratasa de Streptococcus mutans (SEC ID N°: 168), por el cual se Identifican un segundo subconjunto de secuencias que codifican enzimas [2Fe-2S] DHAD; y

c) analizar el segundo subconjunto de secuencias de la etapa (b) para la presencia de aminoácidos conservados distintivos en las posiciones correspondientes a las posiciones en la secuencia de aminoácidos de DHAD de Streptococcus mutans (SEC ID N°: 168) que son ácido aspártlco en la posición 88, arglnlna o asparaglna en la posición 142, asparaglna en la posición 28 y leucina en la posición 454, por el cual se Identifican adlclonalmente un tercer subconjunto de secuencias que codifica enzimas [2Fe-2S] DHAD.

2. El método de la reivindicación 1 que comprende además

d) expresar un pollpéptldo que tiene una secuencia identificable por una cualquiera o todas de las etapas a), b) y c) en una célula; y

e) confirmar que dicho pollpéptldo tiene actividad de DHAD en la célula.

3. El método de la reivindicación 1 que comprende además

d) purificar una proteína codificada por una secuencia identificable por una cualquiera o todas de las etapas a), b) y

c); y

e) confirmar que dicha proteína es una enzima [2Fe-2S] DHAD por espectroscopia UV-vis y EPR.

4. El método de la reivindicación 1 que comprende además seleccionar una o más secuencias correspondientes a las secuencias de la enzima [2Fe-2S] DHAD bacteriana identificadas en una cualquiera o todas de las etapas a), b) y

c).

5. El método de la reivindicación 2, en el que la célula carece de actividad de DHAD endógena.

6. El método de la reivindicación 4 que comprende además

d) expresar dichas una o más secuencias seleccionadas correspondientes a secuencias de la enzima [2Fe-2S] DHAD bacteriana en una célula; y

e) confirmar que dicha secuencia de enzima tiene actividad de DHAD en la célula.

7. El método de la reivindicación 4 que comprende además

d) purificar una proteína codificada por dichas una o más secuencias seleccionadas correspondientes a secuencias de la enzima [2Fe-2S] DHAD bacteriana, por el cual se produce una proteína purificada; y

e) confirmar que la proteína es una enzima [2Fe-2S] DHAD por espectroscopia UV-vis y EPR.

8. Una célula huésped microbiana que comprende al menos una enzima [2Fe-2S] DHAD heteróloga identificable por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicha enzima [2Fe-2S] DHAD heteróloga no es una enzima de espinaca.

9. La célula huésped microbiana de la reivindicación 8, en la que la enzima [2Fe-2S] DHAD heteróloga comprende:

(a) una secuencia de aminoácidos que coincide con un perfil modelo oculto de Markov preparado usando las proteínas de SEC ID N°: 164, 168, 23, 232, 298, 31, 344 y 346, con un valor de E inferior a 1'5;

b) tres cisteínas conservadas que se corresponden con las posiciones 56, 129 y 21 en la secuencia de aminoácidos de dihidroxi-ácido deshidratasa de Streptococcus mutans (SEC ID N°: 168); y

c) aminoácidos conservados distintivos en las posiciones correspondientes a las posiciones en la secuencia de aminoácidos de DHAD de Streptococcus mutans (SEC ID N°: 168) que son ácido aspártico en la posición 88, arginina o asparagina en la posición 142, asparagina en la posición 28 y leucina en la posición 454.

1. La célula huésped microbiana de las reivindicaciones 8 ó 9, en la que la célula carece de actividad de DHAD endógena.

11. La célula huésped microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 1, en la que la DHAD heteróloga es una DHAD bacteriana.

12. La célula huésped microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en la que la DHAD heteróloga se deriva de Streptococcus mutans o Lactococcus lactis.

13. La célula huésped microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que la enzima [2Fe-2S] DHAD heteróloga tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 168 o SEC ID N°: 232 o una secuencia con al menos el 85 % de identidad o al menos el 95 % de identidad con la misma.

14. La célula huésped microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en la que la célula es una célula bacteriana, preferentemente un miembro de un género de bacterias seleccionado del grupo que consiste en Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium y Brevibacterium, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus y Streptococcus, o una célula de levadura, preferentemente un miembro de un género de levadura seleccionado del grupo que consiste en Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia y Pichia, más preferentemente Saccharomyces cerevisiae.

15. La célula huésped microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en la que la célula huésped comprende una ruta biosintética de isobutanol.

16. La célula huésped microbiana de la reivindicación 15, en la que la ruta biosintética de isobutanol comprende las siguientes conversiones de sustrato en producto:

(i) piruvato en acetolactato;

(ii) acetolactato en 2,3-dihidroxiisovalerato;

(iii) 2,3-dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato;

(iv) a-cetoisovalerato en isobutiraldehído; y

(v) isobutiraldehído en isobutanol.

17. La célula huésped microbiana de la reivindicación 16, en la que

la conversión de sustrato en producto de piruvato en acetolactato se cataliza por una acetolactato sintasa;

la conversión de sustrato en producto de acetolactato en 2,3-dihidroxiisovalerato se cataliza por una cetol-ácido reductoisomerasa;

la conversión de sustrato en producto de 2,3-dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato se cataliza por la DHAD heteróloga;

la conversión de sustrato en producto de a-cetoisovalerato en isobutiraldehído se cataliza por una a-cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada; y

la conversión de sustrato en producto de isobutiraldehído en isobutanol se cataliza por una alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada.

18. La célula huésped microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 17, en la que la célula produce isobutanol.

19. Un método para la producción de isobutanol que comprende:

a) proporcionar la célula huésped microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 18 en la que dicha célula huésped comprende una ruta biosintética de isobutanol; y

b) cultivar la célula huésped de la etapa (a) en condiciones en las que se produce isobutanol.

2. Un método para la conversión de 2,3-dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato que comprende:

a) proporcionar el huésped microbiano de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 18 y una fuente de 2,3- dihidroxiisovalerato; y

b) cultivar la célula huésped microbiana de (a) en condiciones en las que el 2,3-dihidroxiisovalerato se convierte en

a-cetoisovalerato.