Producción de alcoholes de cuatro carbonos por fermentación.

Una célula huésped microbiana recombinante que comprende moléculas de DNA heterólogas que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato a producto:

a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA,

b) acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA,

c) 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA,

d) crotonil-CoA a butiril-CoA,

e) butiril-CoA a butiraldehído, y

f) butiraldehído a 1-butanol;

en donde dicha célula huésped microbiana produce 1-butanol.

Producción de alcoholes de cuatro carbonos por fermentación.

Campo de la invención La invención se refiere al campo de la microbiología industrial y la producción de alcoholes. Más específicamente, se produce 1-butanol por medio de la fermentación industrial de un microorganismo recombinante.

Antecedentes de la invención El butanol es un importante producto químico industrial, útil como un aditivo para combustibles, como una materia prima química en la industria del plástico y como un disolvente de calidad alimentaria en la industria de los alimentos y los condimentos. Cada año se producen de 4, 5 a 5, 5 millones de toneladas de butanol por medios petroquímicos, y probablemente aumentará la necesidad de esta materia prima química.

Se conocen métodos para la síntesis química de 1-butanol, tales como el Proceso Oxo, el Proceso Reppe y la hidrogenación de crotonaldehído (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistr y , 6ª edición, 2003, Wiley-VCH Verlag GmbH and Co., Weinheim, Alemania, volumen 5, páginas 716-719) . En estos procedimientos se utilizan materiales de partida procedentes de productos petroquímicos, y los procedimientos son generalmente costosos y poco respetuosos con el medio ambiente. La producción de 1-butanol a partir de materias primas de origen vegetal minimizaría las emisiones de gases de efecto invernadero y representaría un progreso en la técnica.

También se conocen métodos para producir 1-butanol por biotransformación de otros productos químicos orgánicos. Por ejemplo, Muramoto et al. (Documento JP 63017695) describen un método para la producción de alcoholes, incluyendo butanol, a partir de aldehídos usando cepas de Pseudomonas. Además, Kuehnle et al. (Documento EP 1149918) describen un procedimiento para preparar 1-butanol y 2-butanol mediante la oxidación de hidrocarburos por diversas cepas de Rhodococcus ruber.

También se conocen métodos para producir butanol por fermentación, siendo el procedimiento más popular aquél con que se produce una mezcla de acetona, 1-butanol y etanol, procedimiento al que se hace referencia como proceso ABE (Blaschek et al., Patente de EE.UU. nº 6.358.717) . La fermentación hasta acetona-butanol-etanol (ABE) por Clostridium acetobutylicum es una de las fermentaciones industriales conocidas más antiguas, y se han presentado las rutas y los genes responsables de la producción de estos disolventes [Girbal et al., Trends in Biotechnology 16: 11-16 (1998) ]. Sin embargo, la fermentación real ha sido bastante complicada y difícil de controlar. La fermentación ABE ha decaído continuamente desde los años 1950, y casi todo el butanol es ahora producido por rutas petroquímicas, como se describió anteriormente. En una fermentación ABE típica, el C. acetobutylicum produce primero los ácidos butírico, propiónico, láctico y acético, el pH del cultivo disminuye, el cultivo experimenta un desplazamiento metabólico en "mariposa", y luego se forman 1-butanol, acetona, isopropanol y etanol. En fermentaciones ABE convencionales, el rendimiento de 1-butanol a partir de glucosa es pequeño, típicamente alrededor del 15 por ciento, y raras veces excede del 25 por ciento. En consecuencia, la concentración de 1-butanol en las fermentaciones ABE convencionales es normalmente inferior al 1, 3 por ciento.

Los intentos para maximizar la producción de 1-butanol del proceso ABE mediante la eliminación de todos los demás subproductos disolventes no han resultado totalmente satisfactorios y, por consiguiente, el procedimiento permite producir cantidades significativas de acetona, que no es útil como aditivo para la gasolina. Un procedimiento para la producción de butanol por fermentación en que el 1-butanol fuera el único producto representaría un avance en la técnica.

Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento ambientalmente responsable y económicamente eficaz para la producción de 1-butanol como único producto. La presente invención se enfrenta a esta necesidad a través del descubrimiento de un huésped microbiano recombinante para producción que expresa una ruta biosintética del 1butanol.

Sumario de la invención La invención proporciona un microorganismo recombinante que tiene una ruta biosintética del 1-butanol genéticamente diseñada. El microorganismo genéticamente diseñado puede ser utilizado para la producción comercial de 1-butanol. En consecuencia, la invención proporciona una célula huésped microbiana recombinante que comprende moléculas de DNA heterólogas que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato a producto:

a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA,

b) acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA,

c) 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA,

d) crotonil-CoA a butiril-CoA, e) butiril-CoA a butiraldehído, y

f) butiraldehído a 1-butanol; en donde dicha célula huésped microbiana produce 1-butanol. En otra realización, la invención proporciona un método para la producción de 1-butanol, que comprende:

i) proporcionar una célula huésped microbiana recombinante que comprende moléculas de DNA heterólogas que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato a producto: a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA, b) acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, c) 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA, 10 d) crotonil-CoA a butiril-CoA, e) butiril-CoA a butiraldehído, y

f) butiraldehído a 1-butanol; y ii) poner la célula huésped de (i) en contacto con un sustrato carbonado fermentable bajo unas condiciones mediante las cuales se produce 1-butanol.

Breve descripción de las figuras y las descripciones de secuencias La invención puede ser entendida más a fondo a partir de la descripción detallada, la figura y las descripciones de secuencias adjuntas siguientes, que forman una parte de esta solicitud. En la Figura 1 se muestra la ruta biosintética del 1-butanol. Los pasos marcados como "a", "b", "c", "d", "e" y "f"

representan las conversiones de sustrato a producto descritas más adelante. 20 Las secuencias siguientes se ajustan a 37 C.F.R. 1.821-1.825 ("Requisitos para Solicitudes de Patente que Contienen Descripciones de Secuencias de Nucleótidos y/o Secuencias de Aminoácidos – las Reglas de Secuencias") y son coherentes con la Norma ST.25 (1998) de la Organización Mundial para la Propiedad Intelectual (WIPO; del inglés, World Intellectual Property Organization) y los requisitos de listas de secuencias de la EPO y el PCT [Reglas 5.2 y 49.5 (a-bis) , y la Sección 208 y el Anexo C de las Instrucciones Administrativas]. Los símbolos y 25 el formato utilizados para los datos de secuencias de nucleótidos y aminoácidos cumplen con las reglas expuestas en 37 C.F.R. §1.822. Tabla 1

Sumario de números de ID. SEC. de genes y proteínas

Descripción nº de ID. SEC. del ácido nucleico nº de ID. SEC. del péptido

Acetil-CoA acetiltransferasa thlA de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 1 2

Acetil-CoA acetiltransferasa thlB de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 3 4

Acetil-CoA acetiltransferasa de Escherichia coli 128 129

Acetil-CoA acetiltransferasa de Bacillus subtilis 130 131

Acetil-CoA acetiltransferasa de Saccharomyces cerevisiae 132 133

3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 5 6

3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Bacillus subtilis 134 135

3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Ralstonia eutropha 136 137

3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Alcaligenes eutrophus 138 139

Crotonasa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 7 8

Sumario de números de ID. SEC. de genes y proteínas

Descripción nº de ID. SEC. del ácido nucleico nº de ID. SEC. del péptido

Crotonasa de Escherichia coli 140 141

Crotonasa de Bacillus subtilis 142 143

Crotonasa de Aeromonas caviae 144 145

Supuesta trans-enoil-CoA reductasa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 9 10

Butiril-CoA deshidrogenasa de Euglena gracilis 146 147

Butiril-CoA deshidrogenasa de Streptomyces collinus 148 149

Butiril-CoA deshidrogenasa de Streptomyces coelocolor 150 151

Butiraldehído deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii NRRL B594 11 12

Butiraldehído deshidrogenasa de Clostridium acetobutylicum 152 153

Butanol deshidrogenasa bdhB de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 13 14

Butanol deshidrogenasa bdhA de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 15 16

Butanol deshidrogenasa de Clostridium acetobutylicum 152 153

Butanol deshidrogenasa de Escherichia coli 154 155

Las ID. SEC. números 17-44 son las secuencias nucleotídicas de cebadores oligonucleotídicos usados para

multiplicar los genes de la ruta biosintética del 1-butanol. Las ID. SEC. números 45-72... [Seguir leyendo]

1. Una célula huésped microbiana recombinante que comprende moléculas de DNA heterólogas que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustrato a producto: a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA, b) acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, c) 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA, d) crotonil-CoA a butiril-CoA, e) butiril-CoA a butiraldehído, y

f) butiraldehído a 1-butanol; en donde dicha célula huésped microbiana produce 1-butanol.

2. La célula huésped según la Reivindicación 1, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto de acetil-CoA a acetoacetil-CoA es la acetil-CoA acetiltransferasa.

3. La célula huésped según la Reivindicación 1, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto de acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA es la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa.

4. La célula huésped según la Reivindicación 1, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto de 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA es la crotonasa.

5. La célula huésped según la Reivindicación 1, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto de crotonil-CoA a butiril-CoA es la butiril-CoA deshidrogenasa.

6. La célula huésped según la Reivindicación 1, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto de butiril-CoA a butiraldehído es la butiraldehído deshidrogenasa.

7. La célula huésped según la Reivindicación 1, en donde el polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto de butiraldehído a 1-butanol es la butanol deshidrogenasa.

8. La célula huésped según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en donde la célula es seleccionada del grupo que consiste en: una bacteria, una cianobacteria, un hongo filamentoso y una levadura.

9. La célula huésped según la Reivindicación 8, en donde la célula es un miembro de un género seleccionado del grupo que consiste en Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Cor y nebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces.

10. La célula huésped según la Reivindicación 9, en donde la célula es seleccionada del grupo que consiste en

Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus er y thropolis, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis y Saccharomyces cerevisiae.

11. La célula huésped según la Reivindicación 2, en donde la acetil-CoA acetiltransferasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID. SEC. nº 2, ID. SEC. nº 4, ID. SEC. nº 129, ID. SEC. nº 131 e ID. SEC. nº 133.

12. La célula huésped según la Reivindicación 3, en donde la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID. SEC. nº 6, ID. SEC. nº 135, ID. SEC. nº 137 e ID. SEC. nº 139.

13. La célula huésped según la Reivindicación 4, en donde la crotonasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID. SEC. nº 8, ID. SEC. nº 141, ID. SEC. nº 143 e ID. SEC. nº 145.

14. La célula huésped según la Reivindicación 5, en donde la butiril-CoA deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID. SEC. nº 10, ID. SEC. nº 147, ID. SEC. nº 149, ID. SEC. nº 151 e ID. SEC. nº 187.

15. La célula huésped según la Reivindicación 6, en donde la butiraldehído deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID. SEC. nº 12, ID. SEC. nº 153 e ID. SEC. nº 189.

16. La célula huésped según la Reivindicación 7, en donde la butanol deshidrogenasa tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID. SEC. nº 14, ID. SEC. nº 16, ID. SEC. nº 153, ID. SEC. nº

155 e ID. SEC. nº 157.

17. La célula huésped según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en donde la célula huésped es un anaerobio facultativo.

18. Un método para la producción de 1-butanol, que comprende: 5 i) proporcionar la célula huésped microbiana recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 17; y

ii) poner la célula huésped de (i) en contacto con un sustrato carbonado fermentable bajo unas condiciones mediante las cuales se produce 1-butanol.

19. El método según la Reivindicación 18, en donde el sustrato carbonado fermentable es seleccionado del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.

20. El método según la Reivindicación 18, en donde el sustrato carbonado es seleccionado del grupo que consiste en glucosa, sacarosa y fructosa.

21. El método según la Reivindicación 18, en donde las condiciones mediante las cuales se produce 1-butanol son anaeróbicas.

22. El método según la Reivindicación 18, en donde las condiciones mediante las cuales se produce 1-butanol 15 son microaeróbicas.

23. El método según la Reivindicación 18, en donde la célula huésped es puesta en contacto con el sustrato carbonado en medios mínimos.