Proceso para la producción de polipéptidos.

Un proceso para la producción y aumento de los rendimientos de un polipéptido heterólogo en E.

coli que comprende (a) cultivar, en un medio de cultivo, células de E. coli que comprenden el ácido nucleico que codifica el polipéptido, alimentando al mismo tiempo el medio de cultivo con un organofosfato transportable que se selecciona del grupo que consiste en alfa-glicerofosfato, beta-glicerofosfato, glicerol-3-fosfato y una mezcla de glicerol-2-fosfato y glicerol-3-fosfato, de tal manera que se exprese el ácido nucleico y (b) recuperar el polipéptido de las células, de tal manera que los rendimientos del polipéptido aumenten, en el que durante la etapa de cultivo se añade fosfato inorgánico al medio de cultivo.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/007880.

Solicitante: GENENTECH, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1 DNA WAY SOUTH SAN FRANCISCO, CA 94080-4990 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: SWARTZ, JAMES R., WOON-LAM,SUSAN LEUNG.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07H21/04 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C07K14/47 C07 […] › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de mamíferos.
  • C07K14/65 C07K 14/00 […] › Factores de crecimiento de tipo insulina (Somatomedinas), p. ej. IGF-1, IGF-2.
  • C07K14/705 C07K 14/00 […] › Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie.
  • C07K16/00 C07K […] › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.
  • C07K16/26 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra hormonas.
  • C12N1/20 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Bacterias; Sus medios de cultivo.
  • C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/32 C12N 1/00 […] › Procesos que utilizan alcoholes saturados inferiores, es decir, de C 1 a C 6.
  • C12N1/38 C12N 1/00 […] › Estimulación química del crecimiento o de la actividad por adición de compuestos químicos que no son factores esenciales de crecimiento; Estimulación del crecimiento por eliminación de un compuesto químico (C12N 1/34 tiene prioridad).
  • C12N15/70 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli.
  • C12N15/74 C12N 15/00 […] › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a huéspedes procariotas distintos a E. coli, p. ej. Lactobacillus, Micromonospora.
  • C12P21/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00).
  • C12P21/02 C12P […] › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
  • C12P21/06 C12P 21/00 […] › preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados.

PDF original: ES-2527291_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Proceso para la producción de polipéptidos Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para la producción de un polipéptido heterólogo en E. coli. Más particularmente, la invención se refiere al uso de organofosfato para mejorar el rendimiento de dichos polipéptidos como se define en las reivindicaciones.

2. Descripción de la técnica relacionada

La expresión de proteínas heterólogas por Escherichia coli, con la ayuda de un buen entendimiento de la biología molecular y facilidad relativa en cuanto a la manipulación genética del microorganismo, ha sido muy productiva tanto en el laboratorio como en la industria. Típicamente, para regulación de la expresión de proteínas heterólogas, se emplea un promotor inducible (por ejemplo, el promotor de la fosfatasa alcalina, el promotor tac, el promotor de arabinosa, etc.) . La necesidad de un suceso de inducción proporciona al investigador la oportunidad de controlar el tiempo de expresión de la proteína diana. Esta capacidad es especialmente importante para aquellas proteínas heterólogas que el hospedador no tolera bien a altas concentraciones. Consiguiendo una densidad celular deseable antes de la inducción de la expresión, puede maximizarse el rendimiento volumétrico de la proteína deseada.

El crecimiento de las células cesa cuando se priva al microorganismo de un nutriente requerido. El componente limitante puede ser carbono, nitrógeno, fosfato, oxígeno o cualquiera de los elementos requeridos por la célula. En dichas condiciones, las células salen de la fase de crecimiento. Una manera para atenuar el cultivo de las respuestas frente al estrés producido por la limitación de nutrientes es proporcionar un suministro del componente ausente. Los suministros comunes introducidos en los procesos de fermentación semidiscontinua incluyen glucosa, aminoácidos, oxígeno, etc.

En el caso del fósforo (P) celular, la necesidad de aporte de fosfato no es sorprendentemente dado que el P es el quinto elemento más abundante en una célula detrás del carbono, oxígeno, nitrógeno e hidrógeno. Slanier, Adelberg e Ingraham, The Microbial World, 4ª ed. (Prentice Hall, NJ 1976) , p. 1357. El fósforo es un componente esencial en numerosas macromoléculas tales como ácidos nucleicos, liposacáridos y lípidos de membrana. Además, su papel en los enlaces fosfoanhídrido altamente energéticos hace que sea especialmente importante en el metabolismo energético. E. coli es capaz de utilizar fosfato inorgánico (Pi) , organofosfato o fosfonato como fuente principal de P. La captación de Pi del entorno puede realizarse a través de dos sistemas transportadores, los sistemas Pit y Pst. Para los organofosfatos, la mayoría son no transportables y primero requieren hidrolizarse enzimáticamente en el periplasma antes de que el sistema (o sistemas) de transporte de Pi pueda captar el Pi liberado. Únicamente algunos organofosfatos son transportables, y el glicerol-3-fosfato (G3P) es un ejemplo de este tipo. El G3P y el glicerofosfato-1-fosfato (G1P) se conocen como alfa-glicerofosfatos. En respuesta a limitación de Pi y a la limitación de carbono, E. coli es capaz de captar G3P intacto disponible del medio externo en el compartimiento intracelular, donde el G3P se metaboliza para producir el fosfato o carbono necesarios. Wanner, "Phosphorus Assimulation and Control of the Phosphate Regulon", y en Escherichia coli y Salmonella Cellular y Molecular Biology, Neidhardt, ed., (segunda edición) , American Society for Microbiology Press (1996) , págs.1357-1365.

Referencias adicionales sobre el G3P son Silhavy et al., J. Bacteriol., 126: 951-958 (1976) sobre la proteína periplásmica relacionada con el sistema de transporte de sn-glicerol-3-fosfato en E. coli; Argast et al., J. Bacteriol., 136: 1070-1083 (1978) sobre un segundo sistema de transporte para sn-glicerol-3-fosfato en E. coli; Elvin et al., J. Bacteriol., 161: 1054-1058 (1985) sobre el intercambio de Pi mediado por el sistema de transporte de G3P dependiente de glpT; Rao et al., J. Bacteriol., 175: 74-79 (1993) sobre el efecto de las mutaciones glpT y glpD sobre la expresión del gen phoA en E. coli; y Elashvili et al., Appl. Environ. Microbiol., 64: 2601-2608 (1998) sobre los genes phnE y glpT que potencian la utilización de organofosfatos en E. coli K-12. Adicionalmente, Vergeles et al., Eur. J. Biochem., 233: 442-447 (1995) desvelan la alta eficacia del glicerol-2-fosfato (G2P) , conocido de otra manera como beta-glicerofosfato, y el G3P como aceptores nucleotidílicos en esterificaciones con fosfodiesterasa de veneno de serpiente.

El entendimiento actual de los dos sistemas de transporte para la captación de G3P exógeno en E. coli, los sistemas de transporte Ugp y GlpT, se han resumido bien en el libro Escherichia coli y Salmonella, Cellular and Molecular Biology editado por Neidhardt et. al., (segunda edición) , citado anteriormente, pág. 1364 en relación con las referencias 13 y 81. El operón Ugp pertenece al regulón pho. Este se induce por limitación de fosfato y se regula positivamente a través de la proteína phoB. El sistema Ugp es un sistema de transporte multicomponente dependiente de proteínas de unión periplásmicas, codificando ugpB la proteína de unión periplásmica, codificando ugpA y ugpC proteínas de canales de membrana integrales y codificando ugpC la ATPasa. GlpT es parte del

sistema glp que media la captación y el metabolismo de glicerol, G3P, y fosfodiésteres de glicerol fosforilo (Lin et al., Annu. Rev. Microbiol., 30: 535-578 (1976) ; capítulo 20; págs. 307-342 Dissimilator y Pathways for sugars, polyols and carboxylates. Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, segunda edición) . Este Sistema de transporte es un intercambiador aniónico que se sabe que media la salida de Pi del citoplasma por intercambio con G3P externo. En una cepa de tipo silvestre que crece en G3P, aunque las células que toman G3P liberan poco Pi mediante el sistema Ugp, el Pi puede liberarse en el periplasma cuando el G3P se toma mediante el sistema GlpT. Si como resultado de una afluencia mediada por glpT permeasa, se libera una cantidad represiva de Pi, se cortará la actividad del regulón pho, incluido el sistema Ugp. En determinadas condiciones, GlpT es la única vía para la salida de Pi de la célula por intercambio con G3P externo. Elvin et al., J. Bacteriol., 161: 1054-1058 (1985) ; Rosenberg, "Phosphate transport in prokar y otes, " p. 205-248. In B. P. Rosen and S. Silver (ed.) , Ion Transport in Prokar y otes (Academic Press, Inc., Nueva York, 1987) .

Cuando se comparan las capacidades de los sistemas Ugp y GlpT con el transporte de G3P, las velocidades máximas de los dos sistemas son similares. La afinidad aparente para G3P es mayor con el Sistema Ugp que con el Sistema GlpT. Posiblemente, ambos sistemas podrán aportar suficiente G3P para el crecimiento celular si se encuentran disponibles en el medio de crecimiento. Sin embargo, el G3P transportado exclusivamente mediante el Sistema Ugp puede servir como la única fuente de fosfato pero no de carbono, mientras que el G3P transportado por GlpT puede servir como la única fuente para ambos (Schweizer et al., J Bacteriol., 150: 1154-1163 (1982) ) . Los dos genes ugp que codifican el sistema de transporte de G3P dependiente del regulón pho se han mapeado (Schweizer et al., J. Bacteriol., 150: 1164-1171 (1982) ) , la región ugp que contiene estos genes se ha caracterizado (Schweizer et al., Mol. and Gen. Genetics, 197: 161-168 (1984) ) , y se ha estudiado la regulación del operón ugp (Schweizer et al., J. Bacteriol., 163: 392-394 (1985) ; Kasahara et al., J. Bacteriol., 173: 549-558 (1991) ; Su et al., Molecular & General Genetics, 230: 28-32 (1991) ; Brzoska et al., "ugp-dependent transport system for sn-glycerol 3-phosphate of Escherichia coli, " p. 170-177 in A. Torriani-Gorini, F. G. Rothman, S. Silver, A. Wright, and E. Yagil (ed.) , Phosphate Metabolism and Cellular Regulation in Microorganisms (American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1987) ; Brzoska et al., J. Bacteriol., 176: 15-20 (1994) ; y Xavier et al., J. Bacteriol., 177: 699-704 (1995) ) .

En cepas de tipo silvestre, existe un conjunto intracelular estable de G3P y se mantiene a aproximadamente 200 μM. Internamente, el G3P puede sintetizarse en G3P a través de la conversión enzimática del glicerol por la glicerol quinasa (codificada por glpK) cuando se desarrolla en glicerol como única fuente de carbono, o a partir de la reducción del producto intermedio glucolítico, la dihidroxiacetona fosfato, por la G3P sintasa, el producto génico del gen gpsA, durante el desarrollo en fuentes de carbono distintas de glicerol. Dado que el G3P es un producto intermedio importante... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un proceso para la producción y aumento de los rendimientos de un polipéptido heterólogo en E. coli que comprende (a) cultivar, en un medio de cultivo, células de E. coli que comprenden el ácido nucleico que codifica el polipéptido, alimentando al mismo tiempo el medio de cultivo con un organofosfato transportable que se selecciona del grupo que consiste en alfa-glicerofosfato, beta-glicerofosfato, glicerol-3-fosfato y una mezcla de glicerol-2-fosfato y glicerol-3-fosfato, de tal manera que se exprese el ácido nucleico y (b) recuperar el polipéptido de las células, de tal manera que los rendimientos del polipéptido aumenten, en el que durante la etapa de cultivo se añade fosfato inorgánico al medio de cultivo.

2. El proceso de uno cualquiera de la reivindicación 1, en el que el cultivo se realiza en un matraz agitador o en un fermentador.

3. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el polipéptido se recupera del citoplasma, periplasma o medio de cultivo de las células.

4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la expresión del ácido nucleico se regula por un promotor inducible, particularmente en el que el promotor inducible es el promotor de la fosfatasa alcalina, el promotor tac o el promotor T7.

5. El proceso de la reivindicación 4, en el que la expresión del ácido nucleico comienza al mismo tiempo en la fase del crecimiento activo de la etapa de cultivo.

6. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que la E. coli carece de phoA cromosómico.

7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que la E. coli es de tipo silvestre con respecto al glpT cromosómico.

8. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la E. coli carece de glpT cromosómico.

9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8, en el que la E. coli carece de phoA y glpT cromosómicos, en particular en el que la E. coli no carece de ugp cromosómico.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el polipéptido es un polipéptido eucariota, en particular en el que el polipéptido es un polipéptido de mamífero.

11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el polipéptido es el factor 1 de crecimiento similar a insulina.

12. El proceso de la reivindicación 11, en el que la velocidad de alimentación del organofosfato es de aproximadamente 1 a 7 mmoles/hora para aproximadamente 8-10 litros y el cultivo se realiza en un fermentador de 10 litros, en particular en el que la velocidad de alimentación del organofosfato es de aproximadamente 2 a 6 mmoles/hora para aproximadamente 8-10 litros, más particularmente en el que la velocidad de alimentación del organofosfato es de aproximadamente 3 a 4 mmoles/hora para aproximadamente 8-10 litros.

13. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el polipéptido es Apo2L.

14. El proceso de la reivindicación 13 en el que la velocidad de alimentación del organofosfato es de aproximadamente 4 a 17 mmoles/hora para aproximadamente 8-10 litros y el cultivo se realiza en un fermentador de 10 litros, particularmente en el que la velocidad de alimentación es de aproximadamente 6 a 16 mmol/hora para aproximadamente 8-10 litros, más particularmente en el que la velocidad de alimentación es de aproximadamente 8 a 15 mmol/hora para aproximadamente 8-10 litros, incluso más particularmente en el que la velocidad de alimentación es de aproximadamente 10 a 14 mmol/hora para aproximadamente 8-10 litros.

15. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que la proporción de fosfato inorgánico añadida con respecto al organofosfato varía de aproximadamente 1:10 a 1:0, 25, más particularmente en el que el polipéptido es Apo2L y la proporción es de aproximadamente 1:3 a 1:0, 5, incluso más particularmente en el que la proporción es de aproximadamente 1:1.

 

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