Proceso para la determinación de lipoproteínas en fluidos corporales.

Proceso para determinar concentraciones de subclases de lipoproteína k ≥

1...N en un fluido corporal, estando cada subclase caracterizada por una distribución de densidad y una distribución de tamaño seleccionadas respectivas; comprendiendo el proceso las etapas de

a) registrar o calcular un espectro de referencia de RMN para cada una de dichas subclases de lipoproteína para M condiciones de medición diferentes i ≥ 1...M que son diferentes con respecto a la fuerza de un gradiente de campo magnético de sensibilización por difusión y/o la temperatura,

b) determinar una función de subclase fi,k para cada subclase de lipoproteína k y cada condición de medición i que describe el espectro de referencia de RMN de la subclase de lipoproteína k en las condiciones de medición i,

c) medir los espectros de RMN Si≥1...M de la muestra de fluido corporal a analizar en las mismas M condiciones de medición diferentes que las aplicadas en la etapa a),

d) ajustar las funciones de clase fi,k determinadas en la etapa b) a los espectros de RMN Si usando N factores de ponderación ck de acuerdo con la siguiente fórmula:

e) obtener la concentración de cada subclase de lipoproteína en la muestra de fluido corporal usando el correspondiente factor de ponderación ck.

Proceso para la determinación de lipoproteínas en fluidos corporales

La presente invención se refiere a un proceso para la determinación de la densidad y distribución de tamaño de lipoproteínas en fluidos corporales y a un aparato para realizar este proceso.

La arteriesclerosis que, entre otras cosas, es atribuible a depósitos de colesterol en las paredes vasculares arteriales es una de las causas más frecuentes de muerte en las naciones industrializadas occidentales. Dependiendo de dónde se produzcan los depósitos, pueden producirse disfunción de la circulación sanguínea en el cerebro (ictus), disfunción de la circulación sanguínea en el corazón (cardiopatía coronaria, infarto de miocardio) y enfermedades oclusivas arteriales en las arterias periféricas. Investigaciones realizadas han demostrado que el riesgo de padecer arteriesclerosis corresponde a la proporción de colesterol presente en la sangre. Este colesterol está presente en forma de partículas de lipoproteína que contienen colesterol, por ejemplo, junto con proteínas. Estas lipoproteínas efectúan el transporte de lípidos insolubles en agua en la sangre. Las lipoproteínas pueden subdividirse en diferentes clases de lipoproteínas, entre otras, basándose en su densidad, componentes lipidíeos y apolipoproteínas. El riesgo de padecer arteriesclerosis parece correlacionarse con un alto nivel de colesterol LDL (lipoproteína de baja densidad). Por otro lado, el colesterol en partículas de HDL (lipoproteína de alta densidad) parece contribuir a la eliminación de las placas arterioscleróticas en las paredes vasculares arteriales. Investigaciones posteriores indican que determinados tamaños y distribuciones de densidad dentro de las clases de lipoproteína son un buen indicador para el reconocimiento temprano de enfermedades cardiovasculares y el riesgo de padecer arteriesclerosis (Kuller et al., (22), Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy of lipoproteins and risk of coronary heart disease in the cardiovascular health study, Aterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22, 1175-118; Blake et al., (22), Low-density lipoprotein particle concentration and size as determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy as predictors of cardiovascular disease in women, Circulation 16, 193-1937; Rosenson et al., (22), Relations of lipoprotein subclass levels and low-density lipoprotein size to progression of coronary artery disease in the pravastatin limitation of arteriesclerosis in the coronary arteries (PLAC-I Trial), Am. J. Cardiol. 9, 89-94; Rosenson et al., (22), Effects of pravastatin treatment on lipoprotein subclass profiles and particle size in the PLAC-I trial, arteriesclerosis 16, 41- 48). Por esta razón, se realizan numerosas determinaciones de lipoproteínas en sangre para un reconocimiento precoz de enfermedades cardiovasculares. Se supone que el objeto de hasta 6-8 % de los ensayos de sangre de diagnóstico en el laboratorio es, al menos parcialmente, la determinación de lipoproteína.

A partir del documento EP 361 214 B1, se conoce un proceso para la determinación de la concentración de cuatro lipoproteínas en una muestra plasmática sanguínea por mediciones de RMN. En este proceso, el contorno de línea de un espectro de RMN de una muestra plasmática a analizar se ajusta por una combinación lineal ponderada de los cuatro espectros de referencia de lipoproteína. Refinando los coeficientes de ponderación de los espectros de referencia individuales, pueden calcularse las concentraciones de los cuatro componentes de lipoproteína. En el caso de este proceso, sin embargo, no puede determinarse ninguna distribución de tamaño ni ninguna distribución de densidad dentro de una clase de lipoproteínas.

En el artículo de revisión "Nuclear magnetic resonance chromatography: applications of pulse field gradient diffusion NMR to mixture analysis and ligand-receptor interaction", Journal of chromatography B; 725 (1999), páginas 79-9, se desvela un proceso complicado para investigar interacciones entre proteína-ligando y en cuyo caso se usan las proteínas marcadas específicamente con 13C/15N para espectroscopia RMN, aparte de RMN de gradiente de campo pulsado.

El documento US 6.617.167 B2 describe un método de exploración de un sujeto para detectar la presencia de lipoproteína X. También se describen métodos de clasificación de lipoproteínas. Mediante los mismos, solamente se desvela una clasificación general en clases tales como VLDL, LDL, HDL y quilomicrones.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un proceso para una clasificación y una cuantificación de lipoproteínas en fluidos corporales más fina y precisa que la conocida en la técnica anterior y un aparato para realizar este proceso que está mejorado con respecto a las desventajas mencionadas anteriormente.

Este objeto se consigue de acuerdo con la invención mediante un proceso según la reivindicación 1. Aspectos ventajosos del proceso son la materia objeto de las reivindicaciones adicionales.

El proceso de acuerdo con la invención es un proceso para determinar concentraciones de subclases de lipoproteínas k = 1...N en un fluido corporal, caracterizándose cada subclase por una distribución de densidad y una distribución de tamaño seleccionadas respectivas; comprendiendo el proceso las etapas de

a) registrar o calcular un espectro de RMN de referencia para cada una de dichas subclases de lipoproteína para M condiciones de medición diferentes i = 1...M que son diferentes con respecto a la fuerza de un gradiente de campo magnético de sensibilización por difusión y/o la temperatura,

b) determinar una función de subclase f¡,k para cada subclase de lipoproteína k y cada condición i de medición que describe el espectro de RMN de referencia de la subclase de lipoproteína k en las condiciones de medición i,

c) medir los espectros de RMN S¡_1...m de la muestra de fluido corporal a analizaren las mismas M condiciones de medición diferentes que las aplicadas en la etapa a),

d) ajustar las funciones de clase f¡,k determinadas en la etapa b) al espectro de RMN S¡ usando N factores de ponderación Ck de acuerdo con la siguiente fórmula:

N

Si = ^cfc/i,fc

k

e) obtener la concentración de cada subclase de lipoproteína en la muestra de fluido corporal usando el

correspondiente factor de ponderación Ck.

También se desvela un proceso para la determinación, en particular la clasificación y cuantificación, de lipoproteínas en fluidos corporales. Para esta finalidad, se miden espectros de RMN de una muestra de fluido corporal a analizar en diferentes condiciones de medición. Las diferentes condiciones de medición se seleccionan de tal manera que se permite la separación de líneas de resonancia RMN homogéneas superpuestas de diferentes subclases de lipoproteína. Modificando las condiciones de medición, se implementa una espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) multidimensional y unidimensional ponderada por difusión con gradientes de campo magnético pulsado. Estas condiciones diferentes de medición se seleccionan de diferentes gradientes de campo magnético y diferentes temperaturas. Para esta finalidad, se registran diversos espectros de RMN, por ejemplo, para una muestra plasmática o en suero a diferentes gradientes de campo magnético y/o diferentes temperaturas en cada caso. Los efectos cambiantes de los diferentes gradientes de campo magnético y de las diferentes temperaturas en la forma de señal, por ejemplo, la intensidad y/o la anchura de las señales de RMN de las subclases de lipoproteína individuales se determinan posteriormente y se asigna una determinada distribución de densidad y distribución de tamaño a las subclases de lipoproteína individuales basándose en los efectos diferentes.

Es posible mejorar el proceso modificando otros parámetros tales como la composición de la muestra (disolvente, modificaciones químicas). Para esta finalidad, se registran y se analizan conjuntamente diversos espectros de RMN,

como norma, en diferentes condiciones.

El proceso puede usarse para analizar una amplia diversidad de diferentes especímenes de fluidos corporales, por ejemplo, muestras de plasma sanguíneo y suero en sangre de un origen deseado. Los fluidos corporales adecuados en este aspecto son todos los fluidos corporales que contengan lipoproteínas de diferentes orígenes, por ejemplo, sangre, linfa o fluido de médula espinal. El proceso permite el análisis de señales de RMN de una composición no homogénea en espectros de RMN atribuibles a diversa distribución no homogénea dentro de las subclases de lipoproteínas. Por tanto, las proporciones de colesterol, la distribución de densidad y distribución por tamaño de las partículas... [Seguir leyendo]

1. Proceso para determinar concentraciones de subclases de lipoproteína k = 1...N en un fluido corporal, estando cada subclase caracterizada por una distribución de densidad y una distribución de tamaño seleccionadas respectivas; comprendiendo el proceso las etapas de

a) registrar o calcular un espectro de referencia de RMN para cada una de dichas subclases de lipoproteína para M condiciones de medición diferentes i = 1...M que son diferentes con respecto a la fuerza de un gradiente de campo magnético de sensibilización por difusión y/o la temperatura,

b) determinar una función de subclase f¡,k para cada subclase de lipoproteína k y cada condición de medición i que describe el espectro de referencia de RMN de la subclase de lipoproteína k en las condiciones de medición i,

c) medir los espectros de RMN S¡=i...m de la muestra de fluido corporal a analizar en las mismas M condiciones de medición diferentes que las aplicadas en la etapa a),

d) ajustar las funciones de clase f¡,k determinadas en la etapa b) a los espectros de RMN S¡ usando N factores de ponderación Ck de acuerdo con la siguiente fórmula:

N

,k

e) obtener la concentración de cada subclase de lipoproteína en la muestra de fluido corporal usando el correspondiente factor de ponderación ck.

2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra de fluido corporal es una muestra de plasma o de suero.

3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que se detectan espectros de RMN 1D de muestras de referencia y muestras de suero o muestras de plasma en sangre a analizar.

4. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el que las subclases de lipoproteína se seleccionan entre: quilomicrón-A, quilomicrón-B, quilomicrón-C, restos de quilomicrón, VLDL-A, VLDL-B, VLDL-C, IDL, LDL densa pequeña, LDL-A, LDL-B, LDL-C, HDL-2, HDL-3 y Lp(a).

5. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 4, en el que se determinan además las concentraciones de componentes no lipoproteína en la muestra de plasma o la muestra de suero.

6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que los componentes no lipoproteína se seleccionan entre moléculas orgánicas, en particular lactato, alcohol, aminoácidos, péptidos, ácidos nucleicos, en particular ADN y ARN, ácidos grasos, carbohidratos, compuestos farmacéuticos y proteínas.

7. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el que el gradiente de campo magnético varía exclusivamente como condición de medición.

8. Proceso de acuerdo con la reivindicación anterior, en el que se registran al menos cuatro espectros de RMN 1D de una muestra de RMN a analizar con diferentes gradientes de campo magnético en cada caso.

9. Proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el que se determinan la distribución de densidad y/o la distribución de tamaño y la concentración de otras partículas no homogéneas distintas de las lipoproteínas.

1. Sistema dispuesto para realizar el proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el sistema:

- un espectrómetro de RMN dispuesto para realizar la etapa a) de la reivindicación 1,

- un espectrómetro de RMN dispuesto para realizar la etapa c) de la reivindicación 1,

- una instalación de procesamiento de datos dispuesta para realizar las etapas de proceso b), d) y e), cuando se le proporcionan los datos resultantes de la ejecución de las etapas a) y c) de la reivindicación 1.