La presente invención hace referencia a una microcámara y a un dispositivo de cultivo celular,

monitorizables por resonancia magnética nuclear y otras técnicas de imagen, donde dicha microcámara de cultivo se encuentra encapsulada y alojada en el interior de un chip. Dicha microcámara y dicho dispositivo resultan de fácil manejo para el usuario, permitiendo su manipulación o su reemplazo sin la necesidad de un montaje laborioso, beneficiando además notablemente el estudio de cultivos durante periodos largos de tiempo, superiores a 24 horas.

Microcámara y dispositivo de cultivo celular monitorizables por resonancia magnética nuclear.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia a una microcámara y a un dispositivo de preparación y cultivo de sistemas celulares, monitorizables por resonancia magnética nuclear y otras técnicas de imagen.

Antecedentes de la invención

El cultivo de células in vitro es uno de los métodos fundamentales en la biomedicina actual. La caracterización de biomarcadores en muestras biológicas es capaz, con el uso de las técnicas vigentes, de proporcionar información valiosa para el análisis de especies químicas, así como para facilitar la detección precoz de enfermedades y para el estudio de los sistemas biológicos.

A pesar del gran desarrollo de este campo, aún se desconocen, sin embargo, muchos de los factores que inducen y mantienen la diferenciación observada en distintos tipos de tejidos y que dan lugar, en consecuencia, a diferentes fenotipos. Conocer los mecanismos que regulan dichos factores de diferenciación resulta de especial relevancia en la observación y el estudio del desarrollo de células tumorales y biomarcadores del cáncer.

Las técnicas utilizadas comúnmente en el estado de la técnica para analizar tejidos biológicos incluyen, por ejemplo, el uso de nanosensores y nanopartículas o técnicas basadas en espectrometría de masas, entre otras. Adicionalmente, los citados estudios biológicos pueden realizarse mediante técnicas ópticas, en dispositivos de estructura superficial o tridimensional, cuyo modo de operación se basa en la difusión de dianas en sistemas de detección o en sistemas de resonancia magnética nuclear (RMN), con o sin el uso de agentes de contraste. Un tipo de dichos agentes de contraste incluye la preparación de partículas magnéticas (nanopartículas) que pueden ser fácilmente manipulables por campos magnéticos débiles. La microscopía por RMN ha ido desarrollándose paralelamente a las técnicas de imagen macroscópicas habituales en aplicaciones clínicas y con animales y, recientemente, se ha comenzado a abordar la obtención de imágenes por RMN de células individuales, así como la obtención de perfiles metabólicos en volúmenes de escala celular. Sin embargo, tanto el aumento de resolución de la técnica, como el reducido tamaño de las muestras vivas a investigar, presentan aún retos tecnológicos importantes.

En un intento de reproducir lo más fielmente posible las condiciones en que las células crecen in vivo y, a su vez, de disponer del máximo control sobre su entorno, existen en la actualidad diversos tipos de dispositivos preparados para su análisis por RMN, y que están basados en la combinación de las técnicas de microfluídica y microfabricación, junto con la construcción de matrices tridimensionales que remedan el entorno celular en el seno de los tejidos vivos. De este modo, tanto el aporte de nutrientes, factores de crecimiento y otras señales, así como el intercambio de gases y las fuerzas mecánicas, pueden ser aproximadas a los valores fisiológicos que se pretende simular. Algunos ejemplos del citado tipo de dispositivos son las solicitudes de patente WO2002/041021, EP1500944 y US 5313162, que describen diferentes diseños de microcámaras de cultivo celular, o "microrreactores".

La sofisticación progresiva de las técnicas de fotolitografía empleadas en la fabricación de chips y dispositivos electrónicos microscópicos, ha permitido el diseño de sistemas en los que se combina la microfluídica, con tratamientos especiales de las superficies y la integración de diversos tipos de sensores, para implementar laboratorios a microescala o "lab-on-chips" como, por ejemplo, el dispositivo descrito en la solicitud de patente WO 2009/045551. En la construcción de dicho tipo de dispositivos se emplean gran variedad de materiales, predominando el uso de resinas y polímeros (SU-8, PMMA, PMMS, etc.). Dichos sistemas lab-on-chip suponen una considerable mejora frente a desarrollos anteriores, presentando ventajas tales como el ahorro en el volumen del fluido analizado, lo que reduce costes en los agentes reactivos y disminuye la necesidad de grandes muestras de análisis; tiempos menores de respuesta y de análisis, como consecuencia de que las distancias de difusión son menores; mayor control de los procesos y una respuesta más rápida de los sistemas; la posibilidad de realizar análisis paralelos masivos, así como la producción a gran escala de dispositivos; y proporcionan, además, plataformas más seguras para realizar estudios químicos, biológicos o radiológicos, como consecuencia de su menor volumen.

Si bien el estado de la técnica es capaz de resolver algunos de los desafíos que plantea el desarrollo de microcámaras de cultivo celular, la presente invención supone una mejora frente a ellas, al estar especialmente concebida como una microcámara encapsulada de material transparente y biocompatible, que proporciona una plataforma de dimensiones aptas para un equipo de RMN, pero utilizable, a la vez, junto con técnicas de microscopía, y que resulta al mismo tiempo de fácil manejo para el usuario, permitiendo su manipulación o su reemplazo sin la necesidad de un montaje laborioso. El hecho de tratar con una microcámara encapsulada beneficia notablemente el estudio de cultivos durante periodos largos de tiempo, permitiendo estudios durante tiempos superiores a 24 horas.

Adicionalmente, el diseño de la microcámara de la presente invención, basado en, al menos, dos canales diferenciados para la entrada de las células de cultivo y del medio de cultivo, proporciona un mayor control sobre el flujo de células introducidas, dado que éstas, al poseer su propia vía de entrada, no se ven condicionadas por el flujo propio del medio de cultivo. Dicha característica permite ajustar y corregir el volumen de células de cultivo a medida que las características del experimento lo requieran, sin modificar el flujo del medio empleado para mantener el cultivo estudiado en condiciones óptimas.

La invención resulta especialmente adecuada para estudiar el efecto de fármacos y otros agentes (tales como nanopartículas) permitiendo, además de los usos habituales de inspección visual y obtención de imágenes, el control metabólico de los sistemas celulares mediante RMN, facultad que resulta de especial relevancia para la comprobación y el análisis de efectos tóxicos en las células de cultivo estudiadas.

A lo largo del presente documento, el término "chip" se refiere a un dispositivo plástico de algunos milímetros cuadrados de área, en el que se fabrica la microcámara de cultivo mediante la combinación de procesos de fotolitografía de diferentes capas que se unen entre sí mediante procesos de pegado o técnicas similares de microfabricación, tales como microinyección o "hot embossing".

El término "encapsulado" se interpreta como un empaquetado compacto del chip procedente de la oblea semiconductora sobre la que se fabrica la microcámara, para efectuar la conexión de dicha microcámara con los demás componentes del dispositivo de cultivo celular.

El término "biocompatible" se refiere, dentro del contexto de la presente invención, a la capacidad de un material para alojar cultivos biológicos vivos, sin producir efectos locales perjudiciales en las funciones o la integridad de dichos cultivos, permitiendo de forma natural su desarrollo celular o su respuesta tisular.

Objeto de la invención

Un objeto de la presente invención es una microcámara de cultivo celular encapsulada, monitorizable por RMN y alojada en el interior de un chip. Se consigue con ello un dispositivo de fácil manejo para el usuario, permitiendo su manipulación o su reemplazo sin la necesidad de un montaje laborioso, beneficiando además notablemente el estudio de cultivos durante periodos largos de tiempo, no inferiores a 24 horas.

Un objeto de la presente invención es una microcámara de cultivo celular monitorizable por RMN que comprende, adicionalmente, al menos un canal de entrada de las células de cultivo, al menos, un canal de entrada del medio de cultivo y, al menos, un canal de salida. Ello proporciona un mayor control sobre el flujo de células introducidas, dado que éstas, al poseer su propia vía de entrada, no se ven condicionadas por el flujo propio del medio de cultivo. Dicha característica permite, además, ajustar y corregir el volumen de células de cultivo a medida que las características del experimento lo requieran.

Otro objeto de la invención es una...

1. Microcámara de cultivo celular (2) alojada en el interior de un chip (3) sustancialmente plano, que comprende:

- al menos, un canal de entrada (4) de las células de cultivo;

- al menos, un canal de entrada (5) del medio de cultivo;

- al menos, un canal de salida (6);

- al menos, un canal (12) para la entrada de sensores (13) destinados a la medición de propiedades físicas del cultivo celular, tales como su temperatura, pH, pNO, pSH₂, pO₂ ó PCO₂;

y que es monitorizable por RMN.

2. Microcámara (2) según la reivindicación 1, donde el chip (3) está fabricado con un material transparente y biocompatible, preferentemente con un sustrato Glass-SOI, SOI-PDMS, Glass-Carburo de silicio o SU-8.

3. Microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde su volumen está comprendido entre 1-4 mm³.

4. Microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde sus dimensiones de longitud y anchura son, preferentemente, iguales o inferiores a 2 mm x 2 mm.

5. Microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la anchura del canal de entrada de células de cultivo (4) está comprendida entre 150-500 μm.

6. Microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde los sensores (13) destinados a la medición de propiedades físicas del cultivo celular están fabricados con fibra óptica.

7. Microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde los canales de entrada (4, 5) y de salida (6) se conectan a canales de difusión para la entrada de células de cultivo (8), canales de difusión para la entrada del medio de cultivo (9) y canales de difusión para la salida del medio de cultivo (10), estando divididos dichos canales de difusión (8, 9, 10) a través de tabiques (11).

8. Microcámara (2) según la reivindicación 7, donde los canales de difusión de entrada (9) y de salida (10) del medio de cultivo poseen una anchura menor que las células de cultivo estudiadas, de forma que se favorezca que dichas células permanezcan en el interior de la zona de cultivo (7).

9. Microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde los canales de difusión de entrada de las células de cultivo (8) poseen una anchura de, preferentemente, 200 μm, y los canales de difusión de entrada (9) y de salida (10) del medio de cultivo poseen, preferentemente, una anchura comprendida entre 40-75 μm.

10. Dispositivo de cultivo celular (1), que comprende:

i) una microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-9;

ii) un solenoide plano impreso (16) para la monitorización del cultivo por RMN;

iii) un sistema de fijación encapsulado que comprende el acoplamiento solidario de los elementos i), ii) y una conexión hermética, opcionalmente desacoplable, entre la microcámara (2) y una pluralidad de tubos capilares (26) para la circulación de las células de cultivo y del medio de cultivo;

y que es monitorizable por RMN.

11. Dispositivo (1) según la reivindicación 10, que comprende, al menos un equipo de resonancia magnética nuclear para la monitorización del cultivo celular.

12. Dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-11, donde la distancia de contacto entre el solenoide plano impreso (16) y la microcámara (2) es igual o inferior a 50 μm.

13. Dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que comprende, adicionalmente, al menos un equipo de microscopía para la monitorización del cultivo celular.

14. Dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde los tubos capilares (26) están conectados, opcionalmente, a sistemas de impulsión (27) de los líquidos empleados, a válvulas (29) y/o filtros (30) para regular la circulación de dichos líquidos, así como a contenedores de desecho (28) o a puntos de acceso (31) adicionales para la conexión de otros elementos al sistema.

15. Dispositivo (1) según la reivindicación 14, donde los sistemas de impulsión (27) del fluido son jeringas reguladas mediante microbombas de inyección.

16. Dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-15, donde los tubos capilares (26) que se conectan a los canales (4, 5, 6) poseen una longitud de, al menos, 3 m.

17. Procedimiento de montaje de un dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-16, donde dicho montaje se realiza situando la superficie del chip (3) que aloja la microcámara (2) sobre una base de circuito impreso (14) PCB que posee el solenoide plano impreso (16) para la monitorización del cultivo por RMN, acoplándose dicho chip (3) y la base de circuito impreso (14) a presión entre una base (17) y una cubierta (18), disponiendo la base (17) de un alojamiento (19) sobre el que se asienta el chip (3), una abertura (21) en la parte posterior de la base (17) que permite que los sensores (13) salgan del chip, y unos alojamientos (22) sobre los que se insertan conectores fluídicos (23) para conectar la microcámara (2) a una pluralidad de tubos capilares (26) para la circulación de las células de cultivo y del medio de cultivo.

18. Uso de una microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el estudio y monitorización de cultivos biológicos, preferentemente que comprenden células tumorales.

19. Uso de una microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el estudio del efecto de fármacos sobre cultivos biológicos.

20. Uso de una microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el estudio del efecto de nanopartículas sobre cultivos biológicos.

21. Uso de un dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-16 en el estudio y monitorización de cultivos biológicos, preferentemente que comprenden células tumorales.

22. Uso de un dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-16 en el estudio del efecto de fármacos sobre cultivos biológicos.

23. Uso de un dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-16 en el estudio del efecto de nanopartículas sobre cultivos biológicos.

24. Método de monitorización de un cultivo celular que comprende el uso de una microcámara (2) según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde se acopla dicha microcámara (2) a un equipo de resonancia magnética nuclear.

25. Método según la reivindicación 24 donde, adicionalmente, se monitoriza la microcámara (2) por medio de, al menos, un equipo de microscopía.

26. Método de monitorización de un cultivo celular que comprende el uso de un dispositivo (1) según cualquiera de las reivindicaciones 10-16, donde se acopla dicho dispositivo (1) a un equipo de resonancia magnética nuclear, adaptándose al sistema de imanes de monitorización del citado equipo de resonancia magnética nuclear.

27. Método según la reivindicación 26 donde, adicionalmente, se monitoriza el dispositivo (1) por medio de, al menos, un equipo de microscopía.