Proceso de alta seguridad para la preparación de fracciones de células madre purificadas.

Proceso para preparar fracciones de células madre de origen de tejido adiposo,

que comprende las etapas de:

(a) Recoger o recibir una muestra de tejido adiposo que contiene las células madre;

(b) Lavar la muestra de la etapa (a) con un tampón acuoso adecuado;

(c) Incubar la muestra de la etapa (b) con una enzima capaz de digerir el tejido adiposo y de extraer del mismo las células madre;

(d) Recuperar la fase acuosa del producto de la etapa (c);

(e) Purificar la fase acuosa obtenida en la etapa (d); ~

(f) Valorar la fase acuosa obtenida en la etapa (e) y, si es necesario, diluirla para obtener una fracción de células madre final con una concentración y volumen deseados

donde el material que contiene células madre se trata dentro de una jeringa a lo largo de al menos las etapas:

(a), (b) y (c), realizando dicha jeringa las funciones de medio de recogida, separador de fases y reactor del proceso.

Proceso de alta seguridad para la preparación de fracciones de células madre purificadas.

Las células madre están adquiriendo un interés creciente en la práctica cosmética y médica, junto con su capacidad 5 para generar nuevos tejidos biológicos aplicables a pacientes que, por diversos motivos, han perdido estos tejidos o la capacidad de regenerarlos.

En particular, las células madre adultas, por ejemplo aquellas de origen lipídico o mieloide, han atraído un interés particular, debido a su potencia más controlable y también por estar exentas de las restricciones éticas aplicables a 10 las embriónicas.

Un campo típico de uso para las células madre de origen lipídico es el de relleno tisular con fines cosméticos: aquí, el paciente que requiere el tratamiento dona una parte de su propio tejido adiposo (lipoaspirado) ; éste se procesa por un laboratorio que recupera la fracción celular purificada, siendo la última inyectada de nuevo en el paciente en 15 las zonas del cuerpo que requieren relleno. La fracción celular obtenida se denomina Fracción Vascular Estromal (FVE) y representa el número total de células nucleadas extraídas del tejido adiposo. Típicamente, del 10 al 20% de estas células son células madre, también denominadas células madre mesenquimales. Son pluripotentes y capaces de reparar o regenerar varios tipos de tejidos humanos. El uso de tejido adiposo autólogo evita el riesgo de reacciones inmunes y rechazo del tejido. Además, estas células extraídas después pueden almacenarse congeladas 20 durante largos periodos en nitrógeno líquido a disposición del donante para tratamientos adicionales que incluyan el uso de células madre en terapias con células madre humanas.

Se conocen en la técnica procesos para preparar fracciones celulares purificadas de origen de tejido adiposo.

Estos generalmente comprenden la recuperación del material adiposo sin procesar original, la extracción selectiva del componente de células madre, la eliminación de la matriz lipídica agotada, y el lavado final, purificación y preparación de la fracción de células madre en una concentración y volumen convenientes. Estos procesos, que implican el paso del material que contiene células madre a través de varias pipetas, tubos, vasos de precipitados, etc., implican un riesgo considerable de contaminación bacteriana y/o pérdida de material: por lo tanto, requieren 30 procedimientos muy estrictos en cuanto a la esterilidad del entorno y a los diferentes materiales usados, múltiples lavados para recuperar el material posiblemente adherido, todo ello sumándose al coste total del proceso. Las múltiples transferencias de recipientes también aumentan el riesgo de intercambio accidental de muestras de diferentes pacientes, exponiendo al receptor de las células madre final al riesgo de una transfusión no autóloga.

El procedimiento anterior también requiere una colaboración estricta y un entendimiento entre el operador que recoge la materia prima lipídica y el laboratorio que aísla las células madre. A veces, la materia prima se envía en recipientes no óptimos (por ejemplo, demasiado grandes, sin un apropiado cierre hermético, envasados erróneamente, en cantidades que no son óptimas, etc.) : en todos estos casos, el laboratorio está obligado a trabajar con una muestra de partida sub-óptima, lo que puede afectar a la calidad del producto final. 40

El objetivo de la invención es proporcionar un proceso mejorado para preparar fracciones de células madre de origen de tejido adiposo, que es más seguro para el paciente y más rápido para el operador del proceso.

Un objetivo adicional es simplificar/estandarizar la interfaz y la cooperación entre los operadores que recogen la 45 materia prima lipídica, y los encargados del aislamiento de células madre.

Un objetivo adicional es reducir el número de etapas y manipulaciones implicadas en los procesos para producir fracciones celulares purificadas.

Un objetivo adicional es hacer más rápidos y eficaces los procedimientos médicos/cosméticos que implican el uso de células madre.

RESUMEN

La presente invención se refiere a un proceso para obtener fracciones de células madre de origen adiposo, básicamente en base a las etapas de:

(a) Recoger o recibir una muestra de tejido adiposo que contiene células madre;

(b) Lavar la muestra obtenida en la etapa (a) con un tampón acuoso adecuado; 60

(c) Incubar la muestra obtenida en la etapa (b) con una enzima capaz de extraer las células madre del tejido adiposo que las contienen;

(d) Recuperar la fase acuosa del producto obtenido en la etapa (c) ;

(e) Purificar la fase acuosa obtenida en la etapa (d) ;

(f) Valorar la fase acuosa obtenida en la etapa (e) y diluirla opcionalmente para obtener una fracción de células 65

madre final con una concentración y volumen deseados.

Una característica esencial de la invención consiste en que el material que contiene células madre se trata dentro del mismo dispositivo de recogida (denominado en el presente documento como "dispositivo de recogida individual" o "SCD") , a lo largo de al menos las etapas: (a) , (b) y (c) del proceso descrito en el presente documento. El uso del 5 SCD evita el contacto del material tratado con la atmósfera externa, reduce al mínimo el riesgo de contaminación y la pérdida de material activo vinculado a las múltiples transferencias entre recipientes, y simplifica las manipulaciones totales requerida para obtener fracciones de células madre purificadas.

El SCD es un recipiente estéril capaz de capaz de extraer y liberar un líquido, es decir, una jeringa. El SCD puede 10 tener un gran volumen de llenado (por ejemplo, de 20 a 100 ml) , para permitir una recolección a gran escala de células madre del material lipídico correspondiente. Preferiblemente, es transparente o semi-transparente, con una marca que inclina el volumen de llenado óptimo, y/o zonas destinadas a la escritura o marcado, para identificar la fuente de la muestra.

Como será evidente a partir de la descripción, el SCD cumple las funciones de un dispositivo de recogida (como una pipeta) , un separador de fases y un reactor de procesos, dependiendo de la etapa de proceso particular implicada; por lo tanto, todas estas funciones se realizan ventajosamente sin transferir la muestra de un recipiente a otro, y/o entrar en contacto con la atmósfera externa.

El SCD se usa básicamente a lo largo de las etapas (a) , (b) y (c) del proceso: sin embargo, si se desea, el SCD puede mantenerse también a lo largo de una o más de las etapas (d) , (e) , (f) , con las mismas funciones y ventajas que se han descrito anteriormente. En base a las premisas anteriores, el proceso de la invención comprende las siguientes etapas:

(a) Recoger o recibir, en un SCD, una muestra de tejido adiposo que contiene las células madre;

(b) En dicho SCD, lavar la muestra de la etapa (a) con un tampón acuoso adecuado;

(c) En dicho SCD, incubar la muestra de la etapa (b) con una enzima capaz de digerir el tejido adiposo y extraer del mismo las células madre;

(d) Recuperar la fase acuosa del producto de la etapa (c) ; 30

(e) Purificar la fase acuosa obtenida en la etapa (d) ;

(f) Valorar la fase acuosa obtenida en la etapa (e) y, si es necesario, diluirla para obtener una fracción de células madre final con una concentración y volumen deseados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 35

Etapa (a) :

En esta etapa, una muestra de tejido adiposo que contiene células madre se extrae de una fuente adecuada en el SCD. 40

Los lipoaspirados son muestras típicas de tejido adiposo. La muestra debe ser líquida, o al menos fluida, para el fin del presente proceso; los materiales no fluidos lo suficiente pueden convertirse tal como por homogeneización adicional y/o adición de medios líquidos, por ejemplo, soluciones tamponadas.

En la etapa (a) el SCD se pone en contacto con la muestra de tejido adiposo y se maneja para extraer un volumen adecuado de la misma; la extracción se detiene antes de llenar completamente el volumen disponible del SCD, permitiendo de esta manera una capacidad de extracción adicional (típicamente un medio del volumen del SCD) para lavar los tampones y otros reactivos que se describen a continuación.

La expresión "recoger o recibir" en la etapa (a) tiene en cuenta el hecho de que esta etapa puede realizarse por una institución/operador que es el mismo o diferente de los que realizan las otras etapas (b) - (f) : en la primera opción, en la etapa (a) el operador "recoge" la muestra lipídica y la procesa directamente como en las etapas... [Seguir leyendo]

1. Proceso para preparar fracciones de células madre de origen de tejido adiposo, que comprende las etapas de:

(a) Recoger o recibir una muestra de tejido adiposo que contiene las células madre;

(b) Lavar la muestra de la etapa (a) con un tampón acuoso adecuado;

(c) Incubar la muestra de la etapa (b) con una enzima capaz de digerir el tejido adiposo y de extraer del mismo las células madre;

(d) Recuperar la fase acuosa del producto de la etapa (c) ; 10

(e) Purificar la fase acuosa obtenida en la etapa (d) ;

(f) Valorar la fase acuosa obtenida en la etapa (e) y, si es necesario, diluirla para obtener una fracción de células madre final con una concentración y volumen deseados donde el material que contiene células madre se trata dentro de una jeringa a lo largo de al menos las etapas: (a) , (b) y (c) , realizando dicha jeringa las funciones de medio de recogida, separador de fases y reactor del proceso. 15

2. Proceso según la reivindicación 1, donde la jeringa tiene un volumen de llenado comprendido entre 20 y 100 ml.

3. Proceso según las reivindicaciones 1-2, donde la jeringa se proporciona con una o más marcas para 20 indicar el volumen o volúmenes de llenado óptimos, y/o con áreas para de escritura o etiquetado.

4. Proceso según las reivindicaciones 1-3, donde el material adiposo es un lipoaspirado.

5. Proceso según las reivindicaciones 1-4, donde la etapa (a) y (b-d) respectivamente, se realizan por 25 dos operadores diferentes en ubicaciones distantes entre sí.

6. Proceso según las reivindicaciones 1-5, donde en la etapa (b) el tampón es un tampón PBS complementado con nutrientes enzimáticos.

7. Proceso según las reivindicaciones 1-6, en el que las etapas (b) y/o (c) incluyen orientar la jeringa hacia abajo (aguja hacia abajo) o hacia arriba (aguja hacia arriba) seguido de expulsar la fase proximal a la aguja.

8. Proceso según las reivindicaciones 1-7, donde en la etapa (c) la enzima es una liberasa, y la incubación se realiza durante 20 a 80 minutos, a una temperatura de 30 º C a 45 º C. 35

9. Proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, en el que en la etapa (d) , la mezcla incubada se mezcla con una solución que contiene albúmina, después la fase adiposa se desecha y la fase acuosa se recupera para las etapas posteriores de proceso.

10. Proceso según las reivindicaciones 1-9, donde el material que contiene células madre se mantiene adicionalmente dentro de dicha jeringa durante una o más de las etapas (d) - (e) .

11. Proceso según las reivindicaciones 1-10, donde la purificación en la etapa (e) se realiza por centrifugación (centrifugaciones) y/o filtración (filtraciones) . 45

12. Proceso según las reivindicaciones 1-11, donde la fracción de células madre final se formula como una o más unidades de 1-5 ml, con una concentración de células nucleadas total comprendida entre 108 a 104 células/ml.