Procedimientos para producir preparaciones de viriones de AAV recombinantes sustancialmente exentas de cápsidas vacías.

Uso de cromatografía de intercambio aniónico o catiónico para separar partículas de vectores de AAV de cápsidas vacías de AAV.

Procedimientos para producir preparaciones de viriones de AAV recombinantes sustancialmente exentas de cápsidas vacías

CAMPO TECNICO

[0001] La presente invención se refiere a procedimientos para purificar viriones de virus adenoasociados (AAV).Más particularmente, la invención se refiere a procedimientos para purificar viriones de AAV recombinantes (rAAV) que contienen genomas empaquetados procedentes de mezclas de viriones de AAV que contienen viriones de rAAV empaquetados y cápsidas vacías de AAV que carecen de dichos genomas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Los procedimientos de terapia génica en desarrollo administran de manera segura y persistente cantidades terapéuticamente eficaces de productos génicos a los pacientes. Usando estos procedimientos, se puede introducir directamente una molécula de ácido nucleico en un paciente (terapia génica in vivo), o en células aisladas de un paciente o donante, que a continuación se devuelven posteriormente al paciente (terapia génica ex vivo). El ácido nucleico introducido dirige a continuación a las propias células del paciente o a las células injertadas para producir el producto terapéutico deseado. La terapia génica permite también a los médicos seleccionar órganos o dianas celulares específicas (por ejemplo, músculos, células sanguíneas, células cerebrales, etc.) para la terapia.

[0003] Se pueden introducir los ácidos nucleicos en las células del paciente de diversas formas, que incluyen la administración génica mediada por virus, la administración de ADN puro, y los procedimientos de transfección. Se ha usado la administración génica mediada por virus en una mayoría de pruebas de terapia génica. C. P. Hodgson Biotechnology (1995) 13: 222-225. Los virus recombinantes más frecuentemente usados se basan en retrovirus, adenovirus, virus del herpes, virus de la viruela, y virus adenoasociados (AAV).

[0004] Los vectores de virus adenoasociados recombinantes son prometedores como vectores de administración génica en la terapia génica humana. Sin embargo, un significativo obstáculo para usar dichos vectores como fármacos es el desarrollo de un procedimiento verdaderamente escalable para producir y purificar el vector a niveles comercialmente viables. Para una revisión de los desafíos implicados en la producción de un vector de AAV escalable para uso comercial, véase Qu y Wright, Cur. Opin. Drug Disc. and Develop. (2000) 3: 750-755. Recientemente, se han desarrollado algunas técnicas de cromatografía en columna para purificar viriones de rAAV. Aunque estos procedimientos de purificación basados en la cromatografía en columna han demostrado que se pueden purificar viriones de rAAV a gran escala, la preparación de viriones purificados usando la cromatografía en columna contiene una cantidad significativa de cápsidas vacías de AAV. La relación típica de cápsidas vacías a viriones que contienen un gen heterólogo de interés ("partículas de vector de AAV") es aproximadamente de 10 o más, es decir, el 90% de los vectores recuperados son cápsidas vacías.

[0005] La presencia de una gran cantidad de cápsidas vacías puede impedir aplicaciones clínicas, por ejemplo estimulando respuestas inmunes no deseadas a la proteína de la cápsida o compitiendo por los sitios de unión a la superficie de la célula diana. En consecuencia, se han desarrollado técnicas para eliminar las cápsidas vacías de las preparaciones de viriones de rAAV. Estas técnicas se basan normalmente en la ultracentrifugación, por ejemplo, centrifugación en gradiente de cloruro de cesio o iodixanol. Dichas técnicas de centrifugación son extremadamente laboriosas, dando como resultado un rendimiento bajo del vector, y no son escalables. Kaludov y col., (2002) Hum. Gene Ther. 13: 1235-1243, describen procedimientos de purificar vectores de rAAV-2, rAAV-4 y rAAV-5 usando columnas de intercambio aniónico. Sin embargo, los experimentadores fueron solo capaces de recuperar el 2%, 0,6% y 6,3%, respectivamente, como genomas empaquetados, incluso tras combinar los eluatos y concentrar las fracciones.

[0006] De esta manera subsiste una necesidad de nuevas formas de eliminar o reducir el número de cápsidas vacías de las disoluciones madre de partículas de vectores AAV con el fin de mejorar la capacidad de

fabricación.

CARACTERÍSTICAS RESUMIDAS DE LA INVENCIÓN

[0007] La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones.

[0008] La presente invención se basa en el descubrimiento de procedimientos eficaces y comercialmente viables de preparación de disoluciones madre de viriones de rAAV con cantidades reducidas de cápsidas vacías. Los inventores han encontrado en el presente documento que se pueden separar cápsidas vacías de viriones de rAAV que contienen material genético ("partículas de vector de AAV") usando técnicas de cromatografía en columna. Este resultado es sorprendente ya que se creía anteriormente que las cápsulas vacías y empaquetadas tenían

idénticas propiedades superficiales. Hasta donde llega el conocimiento de los inventores, esta es la primera demostración de que la carga de las partículas víricas y/o la densidad de carga son diferentes entre las partículas vacías y las partículas llenas. Las técnicas descritas en el presente documento proporcionan procedimientos eficaces y escalables para separar cápsidas vacías de AAV de partículas de vectores de AAV.

[0009] Según esto, en una realización, el uso de la invención se dirige a un procedimiento para purificar partículas de vectores de AAV procedentes de una preparación de AAV que comprende partículas de vectores de AAV y cápsidas vacías de AAV, para proporcionar un producto de AAV sustancialmente exento de cápsidas vacías de AAV. El procedimiento comprende:

(a) proporcionar una célula hospedadora que comprende partículas de vectores de AAV;

(b) lisar la célula hospedadora para obtener un lisado celular bruto que comprende partículas de vectores de AAV y cápsidas vacías de AAV;

(c) aplicar el lisado celular bruto a una primera columna de cromatografía de intercambio catiónico en condiciones en las que las partículas de vectores de AAV y las cápsidas de AAV se unen a la columna;

(d) eluir las partículas de vectores de AAV y las cápsidas vacías de AAV en condiciones de no separación para proporcionar una preparación de AAV que comprende partículas de vectores de AAV y cápsidas vacías de AAV;

(e) aplicar la preparación de AAV procedente de (d) a una segunda columna de cromatografía de intercambio catiónico en condiciones en las que las partículas de vectores de AAV y las cápsidas vacías se unen a la columna;

(f) añadir un tampón bajo en sal a la columna de (e) en condiciones en las que las partículas de vectores de AAV se eluyen y las cápsidas vacías de AAV permanecen unidas a la columna; y

(g) recoger las fracciones eluidas de (f) que comprenden partículas de vectores de AAV para proporcionar un producto de AAV sustancialmente exento de cápsidas vacías de AAV.

[00010] En realizaciones adicionales, el anterior procedimiento comprende además:

(h) aplicar las fracciones procedentes de la etapa (g) a una columna de cromatografía de intercambio aniónico en condiciones en las que las partículas de vectores de AAV y las cápsidas vacías de AAV, si están presentes, se unen a la columna;

(i) añadir un tampón bajo en sal a la columna de (h) en condiciones en las que las cápsidas vacías de AAV se eluyen y las partículas de vectores de AAV permanecen unidas a la columna;

(j) añadir un tampón alto en sal a la columna de (i) en condiciones en las que se eluyen las partículas de

vectores de AAV;

(k) recoger fracciones de (i) que comprenden partículas de vectores de AAV para proporcionar un producto de AAV sustancialmente exento de cápsidas vacías de AAV.

[0011] En una realización más adicional, el uso de la invención se dirige a un procedimiento para purificar partículas de vectores de AAV procedentes de una preparación de AAV que comprende partículas de vectores de AAV y cápsidas vacías de AAV, para proporcionar un producto de AAV sustancialmente exento de cápsidas vacías de AAV. El procedimiento comprende:

(a) proporcionar una célula hospedadora que comprende partículas de vectores de AAV;

(b) lisar la célula hospedadora para obtener un lisado celular bruto que comprende partículas de vectores de AAV y cápsidas vacías de AAV;

(c) clarificar el lisado celular bruto para proporcionar un lisado celular clarificado;

(d) aplicar el lisado celular clarificado a una primera columna de intercambio catiónico que comprende una matriz del ligando funcional... [Seguir leyendo]

1. Uso de cromatografía de intercambio aniónico o catiónico para separar partículas de vectores de AAV de cápsidas vacías de AAV.

2. Uso de cromatografía de intercambio aniónico o catiónico para reducir el número de cápsidas vacías de AAV en una preparación de AAV que comprende partículas de vectores de AAV y cápsidas vacías de AAV, en el que dicha preparación de AAV es preferiblemente una disolución madre purificada de viriones de AAV.

3. Uso, según la reivindicación 2, en el que dicha cromatografía de intercambio aniónico o catiónico reduce el 10 número de cápsidas vacías de AAV en una preparación de AAV, de manera que las partículas de vectores de AAV comprenden al menos aproximadamente el 75%, preferiblemente al menos aproximadamente el 85%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, de los viriones de AAV que están presentes en la preparación.

4. Uso de cromatografía de intercambio aniónico o catiónico para purificar partículas de vectores de AAV de una 15 mezcla de partículas de vectores de AAV y cápsidas vacías de AAV.

5. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha cromatografía de intercambio aniónico o catiónico es cromatografía de intercambio aniónico.

6. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha cromatografía de intercambio aniónico o catiónico es cromatografía de intercambio catiónico.