Procedimientos in vitro para detectar cáncer renal.

Procedimiento in vitro para detectar la presencia de cáncer renal en un individuo,

para determinar el estadio o la gravedad de este cáncer en un individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo con este cáncer, que comprende.

a) la detección y/o cuantificación de la proteína Plexina-B1, del ARNm del gen plexina-B1 o el correspondiente ADNc en una muestra de un individuo, y

b) la comparación de la cantidad de proteína Plexina-B1, de la cantidad de ARNm del gen plexina-B1 o de la cantidad del correspondiente ADNc detectada en una muestra de un individuo con sus valores normales de referencia.

Procedimientos in vitro para detectar cïncer renal

Campo de la invenciïn La presente invenciïn se refiere a un procedimiento in vitro para detectar la presencia de cïncer renal en un individuo, para determinar el estadio, la malignidad o la gravedad de dicho carcinoma en el individuo o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que tiene dicho cïncer; para la bïsqueda, identificaciïn, desarrollo y evaluaciïn de la eficacia de compuestos para terapia para dicho cïncer en un intento de desarrollar nuevos fïrmacos; asï como a agentes inductores de la expresiïn y/o la actividad de la proteïna plexina-B1 o a agentes inhibidores de los efectos de la represiïn de la expresiïn y/o la actividad de la proteïna Plexina-B1.

Antecedentes de la invenciïn A pesar de todos los avances que se han realizado en los ïltimos aïos, el cïncer sigue siendo una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Mïs de 5 millones de nuevos casos de cïncer se diagnostican cada aïo en el mundo y mïs de 3, 5 millones de muertes estïn causadas por los distintos tipos de cïncer, segïn datos de la Agencia Internacional para la Investigaciïn del Cïncer, GLOBOCAN, del aïo 2000.

Las neoplasias renales son tumores frecuentes en las sociedades occidentales; representan el 2% de todos los casos de cïncer. Segïn datos de la Agencia Internacional para la Investigaciïn del Cïncer, GLOBOCAN, del aïo 2000, cada aïo se diagnostican mïs de 90.000 nuevos casos en Europa, 9.000 en Japïn y 30.000 en Amïrica del Norte; mïs de 39.000, 4.000 y 12.000 muertes son causadas por el carcinoma renal cada aïo en Europa, Japïn y Amïrica del Norte, respectivamente; y la mortalidad a escala mundial causada por el carcinoma renal supera los 100.000 casos anuales.

Avances en el conocimiento de la Genïtica del cïncer han permitido la clasificaciïn de distintos tipos de tumores renales. El subtipo mïs comïn es el carcinoma convencional de cïlulas renales, que es diferente de los subtipos papilar, cromïfobo o ductal colector. El oncocitoma renal es una neoplasia benigna, indistinguible en ocasiones del carcinoma renal, que es una neoplasia maligna. Estudios previos han demostrado que todos estos subtipos histolïgicos son distintos genïtica y biolïgicamente, y que tanto su morfologïa como comportamiento estïn determinados por factores moleculares distintivos (Kovacs G., y col., J. Pathol., 1997, 183:131-133) .

En la actualidad, los sistemas de diagnïstico del cïncer renal estïn basados en la identificaciïn de sïntomas clïnicos y en tïcnicas radiolïgicas. Los sïntomas mïs comunes son hematuria (en el 50-60% de los pacientes) , dolor abdominal (en el 40% de los pacientes) y una masa palpable en el flanco del abdomen (en el 30-40% de los pacientes) (Ritchie A.W.S. y Chisholm G.D., Semin. Oncol., 1983, 10:390-400) . La combinaciïn simultïnea de estos sïntomas ("triada clïsica") se produce en menos del 10% de los pacientes. Tumores pequeïos, localizados, raramente producen sïntomas, retrasando el diagnïstico a estadios avanzados. El 25% de los tumores se diagnostican por tomografïa computerizada y ultrasonografïa (Porena M., y col., J. Clin. Ultrasound, 1992, 20:395400; Konnack J.W. y Grossman H.B., J. Urol., 1985, 134:1094-1096; Thompson I.M. y Peek M., J. Urol., 1988, 140:487-490) ; los tumores diagnosticados con estas tïcnicas son normalmente mïs pequeïos que los que producen sïntomas y son mïs fïcilmente resecables para conseguir la curaciïn (Konnack J.W. y Grossman H.B., J. Urol., 1985, 134:1094-1096; Thompson I.M. y Peek M., J. Urol., 1988, 140:487-490; Smith S.J., y col., Radiology, 1989, 170:699-703) .

La alteraciïn de los niveles de expresiïn gïnica estï estrechamente relacionada con el crecimiento celular descontrolado y con procesos de desdiferenciaciïn, hechos comunes a todos los tipos de cïncer. Los niveles de expresiïn de los denominados "genes supresores de tumores", que actïan para evitar el crecimiento celular maligno, estïn reprimidos en las cïlulas tumorales; y los niveles de expresiïn de los denominados "oncogenes", que actïan para inducir el crecimiento maligno, estïn aumentados en las cïlulas tumorales.

Se han asociado muchos genes al desarrollo del cïncer renal, como el gen de von Hippel-Lindau (Seizinger B.R., y col., Nature, 1988, 332:268-269) , el gen del receptor del factor de crecimiento epidïrmico (Ishikawa J., y col., Int. J. Cancer, 1990, 45:1018-1021) , el gen de transformaciïn del factor de crecimiento alfa (Lager D.J., y col., Mod. Pathol., 1994, 7:544) , el oncogïn c-myc (Yao M., y col., Cancer Res., 1988, 48:6753-6757) , genes del metabolismo retinoide (Guo X., y col., Cancer Res., 2001, 61:2774-2781) , o genes de factores de adhesiïn celular (Kuroiwa, K., y col., J. Surg. Oncol., 2001, 77:123-131) . Sin embargo, muchos de los genes implicados en el inicio y la progresiïn de los tumores renales son todavïa desconocidos.

Actualmente no existe ningïn procedimiento no invasivo in vitro que detecte, con niveles aceptables de sensibilidad y especificidad, los tumores renales; un procedimiento no invasivo con alta sensibilidad y especificidad permitirïa la realizaciïn rutinaria de anïlisis clïnicos para la detecciïn de estos tumores. La identificaciïn de genes expresados diferencialmente en carcinomas renales, podrïa permitir la identificaciïn de marcadores biolïgicos, que podrïan tener un alto valor para el diagnïstico in vitro, el pronïstico in vitro y el tratamiento de esta enfermedad (Boer J.M., y col., Genome Res., 2001, 11:1861-1870) . La detecciïn de cambios en el nivel de expresiïn gïnica o en la concentraciïn de las proteïnas codificadas, en fluidos corporales, podrïa ser la base de procedimientos no invasivos de diagnïstico in vitro del cïncer renal.

Una vez que al paciente se le ha diagnosticado un cïncer renal, la resecciïn quirïrgica es el tratamiento de elecciïn. La nefrectomïa radical, que incluye resecciïn del riïïn, grasa perirenal y la glïndula suprarrenal ipsolateral, ha sido generalmente realizada desde los aïos 60 (Robson C.J., y col., J. Urol, 1969, 101:297-301) . La cirugïa que conserva la nefrona se ha utilizado para tratar tumores pequeïos localizados (Herr H.W., Cancer, 1994, 73:160-162) . El parïmetro mïs importante para predecir la supervivencia es la extensiïn anatïmica del tumor. Los pacientes con tumores pequeïos, localizados, que son resecados completamente, tienen unos ïndices de supervivencia mayores que aquellos con afectaciïn nodal o con metïstasis distal. El 20-30% de los pacientes con tumores localizados se curan tras la nefrectomïa radical; menos de un 5% sufren recidivas locales y un 50-60% de los pacientes desarrollan metïstasis a distancia (Rabinovitch R.A., y col., J. Clin. Oncol., 1994, 12:206-212; Sandock, D.S., y col., J. Urol, 1995, 154:28-31) . Una vez que la metïstasis se desarrolla, el pronïstico de supervivencia a largo plazo empeora significativamente; actualmente el 30% de los pacientes que se diagnostican ya se encuentran en un estadio IV, es decir, han desarrollado metïstasis a distancia.

El tratamiento del carcinoma renal es extremadamente difïcil por su capacidad de extenderse sin producir sïntomas, por su inherente resistencia a la quimioterapia sistïmica convencional y por la incapacidad de la radioterapia para reducir los niveles de recaïda tras la nefrectomïa, incluso en pacientes con afectaciïn de los ganglios o tumores no resecados completamente (Kjaer M., y col., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1987, 13:665-672) . Casi el 50% de los pacientes, y el 90-95% de los pacientes con metïstasis a distancia, mueren durante los 5 aïos posteriores al diagnïstico. Frente a esta realidad, estudios de Genïtica Molecular estïn facilitando el conocimiento de la patogïnesis de esta enfermedad y pueden proporcionar nuevas dianas contra las que desarrollar nuevos agentes terapïuticos que sean mïs eficaces que los disponibles en la actualidad.

La familia de proteïnas denominadas plexinas estï compuesta por varias proteïnas con dominios transmembrana citoplasmïtica celular; las Plexinas actïan como receptores de las proteïnas de la familia de las semaforinas, aunque tambiïn se han encontrado expresadas en tejidos extraneuronales con otras funciones moleculares. La Plexina-B1 actïa como receptor de la semaforina III, que es una proteïna que causa el colapso del crecimiento conal de las neuronas y la repulsiïn quïmica de los axones (Driessens M.H., Olivo C., Nagata K., Inagaki, M., Collard J.G., FEBS lett., 2002, 529:168-172) . A dïa de hoy, no se ha demostrado que las Plexinas jueguen un papel en el proceso de carcinogïnesis; sin embargo se ha demostrado que existe un patrïn complejo y dinïmico de interacciïn entre Plexinas... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento in vitro para detectar la presencia de cïncer renal en un individuo, para determinar el estadio o la gravedad de este cïncer en un individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo con este cïncer, que comprende.

a) la detecciïn y/o cuantificaciïn de la proteïna Plexina-B1, del ARNm del gen plexina-B1 o el correspondiente ADNc en una muestra de un individuo, y

b) la comparaciïn de la cantidad de proteïna Plexina-B1, de la cantidad de ARNm del gen plexina-B1 o de la cantidad del correspondiente ADNc detectada en una muestra de un individuo con sus valores normales de referencia.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1, en el que dicha muestra es una muestra de tejido renal.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 2, en el que dicha muestra de tejido renal a analizar se obtiene por cualquier procedimiento convencional, preferentemente nefrectomïa.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1 en el que dicha muestra es una muestra de orina, sangre, plasma, suero, lïquido pleural, lïquido ascïtico, lïquido sinovial, bilis, semen, jugo gïstrico o lïquido cefalorraquïdeo.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1, en el que dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo al que no se le ha diagnosticado previamente cïncer renal.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1, en el que dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo al que se le ha diagnosticado previamente cïncer renal.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1, en el que dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo 20 en tratamiento, o que ha sido tratado previamente, contra cïncer renal.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1, caracterizado por que comprende la extracciïn de la muestra, bien para obtener un extracto de proteïnas o bien para obtener un extracto de ARN total.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1, caracterizado por que la detecciïn y/o cuantificaciïn de la proteïna Plexina-B1 comprende una primera etapa en la que el extracto de proteïnas de la muestra se pone en

contacto con una composiciïn de uno o mïs anticuerpos especïficos contra uno o mïs epïtopos de la proteïna Plexina-B1, y una segunda etapa en la que los complejos formados por los anticuerpos y la proteïna Plexina-B1 se cuantifican.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 9, caracterizado por que dichos anticuerpos comprenden anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, intactos o bien fragmentos recombinantes de los mismos,

anticuerpos combinados y fragmentos Fab o scFv de anticuerpos, especïficos contra la proteïna Plexina-B1; siendo estos anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano.

11. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado por que la detecciïn y/o cuantificaciïn de los complejos formados por los anticuerpos y la proteïna plexina B1, las tïcnicas usadas se seleccionan del grupo formado por: transferencia western, ELISA (ensayo de inmunosorciïn ligado a enzimas) , RIA

(radioinmunoensayo) , EIA Competitivo (Inmunoensayo Enzimïtico Competitivo) , DAS-ELISA (ensayo ELISA de tipo sïndwich con doble anticuerpo) , tïcnicas inmunocitoquïmicas e inmunohistoquïmicas, tïcnicas basadas en el empleo de biochips o micromatrices de proteïnas que incluyen anticuerpos especïficos, ensayos basados en precipitaciïn con oro coloidal en formatos tales como tiras reactivas, o mediante tïcnicas de cromatografïa de afinidad, ensayos de uniïn a ligando o ensayos de uniïn a lectina.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1, caracterizado por que la detecciïn y/o cuantificaciïn del ARNm o del correspondiente ADNc del gen plexina-B1 comprende una primera etapa de amplificaciïn del ARNm, que estï presente en el extracto de ARN total, o del correspondiente ADNc sintetizado por retrotranscripciïn del ARNm; y una segunda etapa de cuantificaciïn del producto de amplificaciïn del ARNm o del ADNc del gen plexina-B1.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 12, caracterizado por que la amplificaciïn se realiza de manera cualitativa o cuantitativa mediante RT-PCR usando cebadores oligonucleotïdicos, en el que las secuencias de los cebadores utilizados para amplificar la secuencia del gen plexina-B1 son las SEC ID Nï 1 y la SEC ID Nï 2.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1, caracterizado por que la detecciïn y/o cuantificaciïn se realiza con sondas especïficas del ARNm o del correspondiente ADNc del gen plexina-B1 mediante tïcnicas tales como 50 transferencia de tipo Northern o transferencia Northern.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1, caracterizado por que la detecciïn del ARNm se efectïa mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real (Q-PCR) .

16. Uso de secuencias nucleotïdicas o peptïdicas derivadas del gen plexina-B1 para detectar in vitro la presencia de cïncer renal en un individuo, para determinar in vitro el estadio o la gravedad de dicho cïncer en el individuo, o para monitorizar in vitro el efecto de la terapia administrada a un individuo que presenta dicho cïncer.

17. Procedimiento in vitro para identificar y evaluar la eficacia de compuestos para terapia del cïncer renal, que comprende:

a) poner en contacto un cultivo de cïlulas renales inmortalizadas con el agente candidato, en las condiciones y durante el tiempo apropiados para permitir que interaccionen,

b) detectar y cuantificar los niveles de expresiïn del gen plexina-B1 o la proteïna Plexina-B1, y

c) comparar dichos niveles de expresiïn con los de cultivos control de cïlulas renales inmortalizadas sin tratar con el compuesto candidato.

18. Uso de secuencias nucleotïdicas o peptïdicas derivadas del gen plexina-B1, en procedimientos de bïsqueda, identificaciïn, desarrollo y evaluaciïn de la eficacia de compuestos para terapia del cïncer renal, en el que dicho uso no es un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugïa o terapia o un procedimiento diagnïstico practicado en el cuerpo humano o animal.

19. Un vector de expresiïn recombinante que expresa la proteïna Plexina-B1 para tratar el cïncer renal.

20. Uso de un vector de expresiïn recombinante que expresa la proteïna Plexina-B1 en la preparaciïn de un medicamento para tratar el cïncer renal.

21. Uso de la proteïna Plexina-B1 en la preparaciïn de un medicamento para tratar el cïncer renal.

22. Composiciïn farmacïutica que comprende una cantidad terapïuticamente eficaz de una proteïna plexina B1 y al menos un excipiente farmacïuticamente aceptable.

23. Composiciïn farmacïutica de acuerdo con la reivindicaciïn 22, caracterizado por que contiene otra sustancia farmacolïgica, preferentemente una inductora de la funciïn de la proteïna plexina B1.

24. Uso de un kit que comprende un anticuerpo que reconoce especïficamente la proteïna plexina B1 y un vehïculo en un envase adecuado para detectar la presencia de cïncer renal en un individuo, para determinar el estadio o la gravedad de este cïncer en un individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada al individuo con este cïncer, en el que dicho uso no es un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugïa o terapia o un procedimiento diagnïstico practicado en el cuerpo humano o animal.

25. Un kit que comprende un par de cebadores diseïado para amplificar especïficamente un ïcido nucleico que tiene una secuencia que es especïfica para el gen plexina-B1, en el que la secuencia del par de cebadores se selecciona de la SEC ID Nï 1 y la SEC ID Nï 2.

26. Uso de un kit que comprende un par de cebadores diseïado especïficamente para amplificar un ïcido nucleico que tiene una secuencia que es especïfica para el gen plexina-B1, para detectar la presencia de cïncer renal en un individuo, para determinar el estadio o la gravedad de dicho cïncer en un individuo o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo con este cïncer.

27. Uso de un kit de acuerdo con la reivindicaciïn 26, en el que la secuencia del par de cebadores se selecciona de la SEC ID Nï 1 y la SEC ID Nï 2.