Polipéptidos con actividad de alfa-amilasa alcalina y ácidos nucleicos que los codifican.

Polipéptido aislado con actividad de alfa-amilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 2 y variantes de la misma que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos un 96% de identidad con los aminoácidos 1 a 485 de la SEC ID nº 2,

donde la variante tiene un rendimiento de lavado mejorado en comparación con la alfa-amilasa progenitora, donde el rendimiento de lavado es determinado bajo las siguientes condiciones de lavado: muestras de prueba ensuciadas con almidón de arroz naranja se lavan durante 15 minutos a 25°C a un pH de 10,5, una dureza del agua de 6 °dH y una proporción Ca:Mg de 2:1 en una solución de 3g/l de detergente modelo A/P que consiste en: 20% de tripolifosfato de sodio, 25% de Na2SO4, 15% de Na2CO3, 20% de sulfonato de alquilbenceno lineal, 5% de alcohol etoxilado C12 -C15, 5% de Na2Si2O5 y 0,3% de NaCl, que contiene 1 mg/l del polipéptido con actividad de alfa-amilasa; después del lavado las muestras se evalúan midiendo la remisión a 460 nm y el rendimiento de lavado se determina como la remisión de las muestras lavadas menos la remisión de una muestra lavada bajo las mismas condiciones pero sin un polipéptido con actividad de alfa-amilasa.

Polipéptidos con actividad de alfa-amilasa alcalina y ácidos nucleicos que los codifican.

Antecedentes de la invención 5

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad de alfa-amilasa y secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos. Además, la invención se refiere a variantes de la alfa-amilasa de la 10 invención. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huésped que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos así como métodos para producir y utilizar los polipéptidos. Además, la invención también se refiere a composiciones para lavandería, lavado de platos y/o limpieza de superficies duras.

Descripción de la técnica relacionada 15

Durante varios años las enzimas alfa-amilasa han sido usadas para una variedad de propósitos diferentes, de los cuales los más importantes son la licuefacción de almidón, desencolado textil, modificación de almidón en la industria del papel y la pulpa, y para elaboración de cerveza y repostería. Otro uso de las alfa-amilasas, que está creciendo en importancia, es la eliminación de manchas amiláceas durante el lavado con un detergente a pH alcalino. 20

Ejemplos de productos de alfa-amilasa comercial son Termamylâ¢, Duramylâ¢, Natalaseâ¢, BAN⢠y Fungamylâ¢, todos disponibles en Novo Nordisk A/S, Dinamarca. Estos productos y similares de otras fuentes comerciales tienen un pH óptimo de ácido a neutro, típicamente en el rango de pH 5 a pH 7, 5, y no muestran actividad óptima en soluciones detergentes a pH alcalino. 25

WO 95/26397 describe una alfa-amilasa de una cepa de Bacillus. WO 96/23873 describe variantes de amilasas de Bacillus con rendimiento mejorado bajo condiciones de lavado.

US 5, 147, 796 describe una pululanasa alcalina con actividad de alfa-amilasa. La fig. 2b del documento muestra 30 una actividad de amilasa óptima a pH 8-8, 5.

M. Takagi et al., J. Ferment. Bioeng., vol. 81, nº 6.557-559 (1996) describe una alfa-amilasa-pululanasa alcalifílica de Bacillus sp. La enzima tiene actividad de amilasa óptima a pH 9, pero la actividad cae rápidamente al aumentar el pH y la actividad a pH 10 es menor que a pH 7. 35

WO 97/00324 (KAO) describe un gen que codifica una alfa-amilasa licuefactante alcalina derivada de la cepa de Bacillus sp. KSM-AP1378 con el número de depósito FERM BP-3048, adecuada para detergentes.

Tsukamoto et. al., (1988) , Biochem. Biophys. Res Commun. 151, p. 25-33) describen una alfa-amilasa alcalina de 40 Bacillus sp. #707.

Es un objetivo de la presente invención el proporcionar alfa-amilasas nuevas con rendimiento alterado, en particular con rendimiento mejorado en soluciones alcalinas, especialmente en las soluciones de detergente alcalinas a pH alrededor de 9-11. 45

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un polipéptido aislado con actividad de alfa-amilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 2 y variantes de la misma que tienen una secuencia de aminoácidos con al 50 menos un 96% de identidad con los aminoácidos 1 a 485 de la SEC ID nº 2, donde la variante tiene un rendimiento de lavado mejorado en comparación con la alfa-amilasa progenitora, donde el rendimiento de lavado es determinado bajo las siguientes condiciones de lavado: muestras de prueba ensuciadas con almidón de arroz naranja se lavan durante 15 minutos a 25º C a un pH de 10, 5, una dureza del agua de 6 º dH y una proporción Ca:Mg de 2:1 en una solución de 3g/l de detergente modelo A/P que consiste en: 20% de tripolifosfato de sodio, 25% de Na2SO4, 15% de Na2CO3, 20% de 55 sulfonato de alquilbenceno lineal, 5% de alcohol C12-C15 etoxilado, 5% de Na2Si2O5 y 0, 3% de NaCI, que contiene 1 mg/l del polipéptido con actividad de alfa-amilasa; después del lavado las muestras se evalúan midiendo la remisión a 460 nm y el rendimiento de lavado se determina como la remisión de las muestras lavadas menos la remisión de una muestra lavada bajo las mismas condiciones pero sin un polipéptido con actividad de alfa-amilasa.

La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos y a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos, así como métodos para producir y utilizar los polipéptidos.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra un alineamiento de varias alfa-amilasas de Bacillus. 5

La figura 2 muestra el perfil de pH de la alfa-amilasa AA560 en comparación con las alfa-amilasas SP722 y SP690.

El perfil de pH fue medido a 37º C. La actividad se muestra en valores absolutos como Abs650/mg de enzima.

La figura 3 muestra el perfil de temperatura de la alfa-amilasa AA560 en comparación con las alfa-amilasas SP722 y SP690.

El perfil de temperatura se muestra como Abs650/mg de enzima. 10

La figura 4 muestra el rendimiento de lavado de la alfa-amilasa AA560 en el detergente 97 modelo AP en comparación con SP722, SP690 y Termamyl®, respectivamente.

La figura 5 muestra el rendimiento de lavado de AA560 en Omo Multi Acao en comparación con SP722, SP690 y Termamyl®, respectivamente.

La figura 6 muestra el rendimiento de lavado de AA560 en Omo concentrado en comparación con SP722, SP690 y 15 Termamyl®, respectivamente.

La figura 7 muestra el rendimiento de lavado de AA560 en Ariel Futur líquido en comparación con SP722, SP690 y Termamyl®, respectivamente.

Descripción detallada de la invención 20

Fuente microbiana

La alfa-amilasa alcalina de la invención se puede obtener de una cepa de Bacillus. Cepas preferidas son Bacillus sp. DSM 12649 (alfa-amilasa AA560) o Bacillus sp. DSM 12648 (alfa-amilasa AA349) . Estas cepas fueron depositadas el 25 de enero de 1999 por los inventores, según las condiciones del tratado de Budapest sobre el reconocimiento 25 internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes en la Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DE.

Dos cepas de Escherichia coli denominadas NN049467 y NN049470 que contienen los genes de alfa-amilasa clonados en los plásmidos pLiH1274 y pTVB299, respectivamente, han sido también depositadas el 7 de abril de 1999 30 según las condiciones del tratado de Budapest con la Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DE, y se les ha dado los números de acceso DSM12761 y DSM12764, respectivamente.

Polipéptidos con actividad de alfa-amilasa 35

Las alfa-amilasas (alfa-1, 4-glucan-4-glucanohidrolasas, EC 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de almidón y otros oligo y polisacáridos 1, 4-glucosídicos lineales y ramificados. A efectos de la presente invención, la actividad de alfa-amilasa se determina usando el ensayo de Phadebas o el ensayo pNPG7 descritos más adelante en la sección "Materiales y métodos". 40

Homología de enzima

En una primera realización, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 2 (es decir, el polipéptido maduro) y variantes de los mismos con al menos 45 aproximadamente un 96%, preferiblemente al menos aproximadamente un 97%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 98%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% de identidad con los aminoácidos 1 a 485 de la SEC ID nº 2, que tienen actividad de alfa-amilasa (de ahora en adelante "polipéptidos homólogos") y que tienen un rendimiento de lavado mejorado en comparación con la alfa-amilasa progenitora tal y como se ha definido anteriormente. En una realización preferida, las variantes tienen una secuencia de aminoácidos que 50 difiere en cinco aminoácidos, preferiblemente en cuatro aminoácidos, más preferiblemente en tres aminoácidos, incluso más preferiblemente en dos aminoácidos y de la forma más preferible en un aminoácido de los aminoácidos 1 a 485 de la SEC ID nº 2 o la SEC ID nº 4. Debe notarse que la SEC ID nº 2 y la SEC ID nº 4 son idénticas. Sin embargo, las secuencias de ADN, es decir, la SEC ID nº 1 y la SEC ID nº 3, respectivamente, que codifican la alfa-amilasa de la invención mostrada en la SEC ID nº 2 y la SEC ID nº 4 no son idénticas. 55

La homología de la secuencia de aminoácidos se puede determinar como el grado de homología entre las dos secuencias que indica una derivación de la primera secuencia respecto de la segunda.... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido aislado con actividad de alfa-amilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 2 y variantes de la misma que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos un 96% de identidad con los aminoácidos 1 a 485 de la SEC ID nº 2, donde la variante tiene un rendimiento de lavado mejorado en comparación con 5 la alfa-amilasa progenitora, donde el rendimiento de lavado es determinado bajo las siguientes condiciones de lavado: muestras de prueba ensuciadas con almidón de arroz naranja se lavan durante 15 minutos a 25º C a un pH de 10, 5, una dureza del agua de 6 º dH y una proporción Ca:Mg de 2:1 en una solución de 3g/l de detergente modelo A/P que consiste en: 20% de tripolifosfato de sodio, 25% de Na2SO4, 15% de Na2CO3, 20% de sulfonato de alquilbenceno lineal, 5% de alcohol etoxilado C12 -C15, 5% de Na2Si2O5 y 0, 3% de NaCl, que contiene 1 mg/l del polipéptido con actividad de 10 alfa-amilasa; después del lavado las muestras se evalúan midiendo la remisión a 460 nm y el rendimiento de lavado se determina como la remisión de las muestras lavadas menos la remisión de una muestra lavada bajo las mismas condiciones pero sin un polipéptido con actividad de alfa-amilasa.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que consiste en los aminoácidos 1 a 485 de la SEC ID nº 2. 15

3. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

4. Secuencia de ácidos nucleicos aislada según la reivindicación 3 que comprende una secuencia de ácidos nucleicos 20 con al menos una mutación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEC ID nº 1, en la que la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que consiste en los aminoácidos 1 a 485 de la SEC ID nº 2.

5. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según las reivindicaciones 3-4.

6. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 5.

7. Método para producir una secuencia de ácidos nucleicos mutante según las reivindicaciones 3 o 4, que comprende (a) introducir al menos una mutación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEC ID nº 1, donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que consiste en los aminoácidos 1 a 485 de la SEC ID nº 30 2; y (b) recuperar la secuencia de ácidos nucleicos mutante.

8. Método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que comprende (a) cultivar una célula huésped según la reivindicación 6 bajo condiciones adecuadas para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. 35

9. Método según la reivindicación 8 para producir un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que comprende (a) cultivar una célula huésped según la reivindicación 6 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido, donde la célula huésped comprende una secuencia de ácidos nucleicos mutante con al menos una mutación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de la SEC ID nº 1, donde la secuencia de ácidos nucleicos 40 mutante codifica un polipéptido que consiste en los aminoácidos 1 a 485 de la SEC ID nº 2, y (b) recuperar el polipéptido.

10. Polipéptido según la reivindicación 1, donde dicho polipéptido tiene una o varias mutaciones, en particular sustituciones o deleciones, en las siguientes posiciones (con respecto a la SEC ID nº 2) : 45

1: R181*, G182*, D183*, G184*;

2: N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

3: 1206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

4: E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

5: E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; 50

6: K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

7: R181A, N, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

donde el polipéptido es preferiblemente seleccionado del grupo de mutantes con las siguientes mutaciones:

- R181*/G182*/N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- G182*/D183*/N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; 55

- D183*/G184*/R181A, N, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- D183*/G184*/N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- R181*/G182*/1206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y;

- G182*/D183*/1206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y;

- D183*/G184*/I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y; 60

- R181*/G182*/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- G182*/D183*/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- D183*/G184*/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- R181*/G182*/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- G182*/D183*/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; 65

- D183*/G184*/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- R181*/G182*/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- G182*/D183*/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- D183*/G184*/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V /I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y

- N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V /E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V; 5

- N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V /E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

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- I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y /E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- 1206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y /E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y /K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; 10

- E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V /E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V /K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V /K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

y donde el polipéptido preferiblemente comprende además una sustitución en la posición E216Q, y donde * denota una deleción. 15

11. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o variante según la reivindicación 10 en:

(a) una composición detergente, en particular una composición detergente para ropa y una composición detergente de lavavajillas; o (b) una composición de desencolado; o 20

(c) para licuefacción de almidón; o (d) para producción de etanol.