Procedimiento de modificación de la morfología, la fisiología y la bioquímica de plantas que comprende la expresión de citoquinina oxidasa en las semillas.

Un procedimiento para aumentar el número de semillas llenas de una planta,

consistiendo dicho procedimiento en (i) introducir en una célula vegetal una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una citoquinina oxidasa unida operablemente a un promotor que dirige específicamente la expresión en el embrión y/o la aleurona de una semilla, y (ii) aumentar el nivel y/o la actividad de dicha citoquinina oxidasa en el embrión y/o la aleurona de la semilla de una planta, en el que dicha molécula de ácido nucleico aislada que codifica una citoquinina oxidasa es un ácido nucleico que codifica la proteína representada por SEQ ID NO:36, o es una molécula de ácido nucleico que codifica CKX2 que se hibrida específicamente en 0,1 a 1x SSC y SDS al 0,1% en p/v a 60 ºC con dicho ácido nucleico que codifica la proteína de SEQ ID NO:36, y en el que dicho promotor comprende los nucleótidos 1-1256 de SEQ ID NO:41.

Procedimiento de modificaciïn de la morfologïa, la fisiologïa y la bioquïmica de plantas que comprende la expresiïn de citoquinina oxidasa en las semillas La presente invenciïn se refiere, en geneal, a procedimientos para modificar las propiedades o las caracterïsticas morfolïgicas de plantas, tales como procesos del desarrollo, y en particular el desarrollo de semillas y/o un mayor rendimiento de semillas de una planta. Los procedimientos comprenden expresar una proteïna de control de la degradaciïn de citoquinina, en particular citoquinina oxidasa 2, en la planta, operablemente bajo el control de una secuencia de promotor regulable, en el que el promotor regulable es una secuencia de promotor especïfica de la aleurona y/o del embriïn. La presente invenciïn se extiende a construcciones genïticas que son ïtiles para realizar el procedimiento de la invenciïn y a plantas transformadas con estas, teniendo dichas plantas unas propiedades morfolïgicas alteradas, comparadas con sus homïlogos por lo demïs isogïnicos.

Las semillas son la unidad de reproducciïn de las plantas superiores. Las semillas contienen compuestos de reserva para asegurar la nutriciïn del embriïn despuïs de la germinaciïn. Estos compuestos de almacenamiento contribuyen significativamente a la nutriciïn humana, asï como a la alimentaciïn del ganado. Las semillas consisten en tres partes principales, a saber, el embriïn, el endospermo y la cubierta de la semilla. Los compuestos de reserva se depositan en los tejidos de almacenamiento, que son el endospermo (que resulta de una fertilizaciïn doble, por ejemplo, en todos los cereales) , el denominado perispermo (derivado del tejido de nucela) o los cotiledones (por ejemplo, variedades de legumbres) . El endospermo estï cubierto por una capa de cïlulas citoplïsmicas densa, conocida como aleurona. Los compuestos de almacenamiento incluyen lïpidos (aceite de colza) , proteïnas (por ejemplo, en la aleurona de cereales) o carbohidratos (almidïn, oligosacïridos como la rafinosa) .

El almidïn es el compuesto de almacenamiento en las semillas de los cereales. Las especies de cereales mïs importante son el maïz (producciïn anual de aproximadamente 570 millones de toneladas) , el arroz (540 millones de toneladas anuales) y el trigo (530 millones de toneladas anuales) . Las semillas ricas en proteïnas incluyen diferentes tipos de legumbres (Phaseolus spec., Vicia faba, Vigna spec.; aproximadamente 20 millones de toneladas anuales) , guisante (Pisum sativum; un millïn de toneladas anuales) y soja (Glycine max; 136 millones de toneladas anuales) . Las semillas de soja tambiïn son una importante fuente de lïpidos, asï como las semillas de diferentes especies de Brassica (aproximadamente 30 millones de toneladas anuales) , algodïn, sïsamo oriental, lino, amapola, ricino, girasol, cacahuete, coco, palma y algunas otras plantas de menor importancia econïmica.

Despuïs de la fertilizaciïn, la semilla en desarrollo se convierte en un ïrgano sumidero que atrae compuestos nutricionales desde ïrganos fuente de la planta y los utiliza para producir los compuestos de reserva en los ïrganos de almacenamiento, tales como semillas, bulbos o tubïrculos. El concepto comïn predice que las citoquininas son un regulador positivo de la fuerza de sumidero.

Numerosos informes atribuyen una funciïn estimuladora o inhibidora a las citoquininas en diferentes procesos del desarrollo, tales como el crecimiento y la ramificaciïn de raïces, el control de la dominancia apical en el brote, el desarrollo de cloroplastos, y la senescencia de las hojas (Mok M.C. (1994) , en Cytokines: Chemistr y , Activity and Function, eds., Mok, D.W.S. & Mok, M.C. (CRC Boca Ratïn, FI) , pp.155-166) . Se han extraïdo conclusiones acerca de las funciones biolïgicas de las citoquininas principalmente de estudios sobre las consecuencias de la aplicaciïn de citoquininas exïgenas o de niveles de citoquininas potenciados de modo endïgeno (Klee, H.J. y Lanehon, M.B. (1995) , en Plant Hormones: Physiology, Biochemistr y and Molecular Biology, ed. Davies, P.J. (Kluwer, Dordrecht, Païses Bajos) , pp. 340-353; Schmïlling, T., Rupp, H.M., Frank, M. y Schafer, S. (1999) , en Advances in Regulation of Plant Growth and Development, eds. Surnad, M. Pac P. y Beck, E. (Peres, Praga) , pp. 85-96) .

La clonaciïn de la citoquinina oxidasa ha permitido el estudio de la importancia de las citoquininas de tipo iP y Z durante el ciclo vital completo de las plantas superiores. La enzima catabïlica citoquinina oxidasa (CKX) desempeïa un papel principal en el control de los niveles de citoquinina en tejidos vegetales. Se ha descubierto actividad CKX en un gran nïmero de plantas superiores y en diferentes tejidos vegetales. La enzima es una oxidorreductasa que contiene FAD que cataliza la degradaciïn de citoquininas que portan cadenas laterales de isoprenoides insaturados y a veces se denomina citoquinina deshidrogenasa (Frïbortova et al., Biochem. J., 380, 121-130, 2004) . Las bases libres iP y Z, y sus respectivos ribïsidos, son los sustratos preferidos. Los productos de la reacciïn del catabolismo de iP son adenina y el aldehïdo insaturado 3-metil-2-butonal (Armstrong, D.J. (1994) , en Cytokinins: Chemistr y , Activity and Functions, eds. Mok. D.W.S & Mok, M.C. (CRC Boca Ratïn, FL) , pp. 139-154) .

Se han aislado los genes de citoquinina oxidasa de diversas especies vegetales: Zea mays (Morris, R.O., Bilyeu, K.D., Laskey, J.G. y Cherich, N.N. (1999) , Biochem. Biophys. Res. Commun., 255, 328-333; Houba-Herin, N., Pethe, C., d’Alayer, J. y Laloue, M. (1999) , Plant J., 17, 615-626) ) , Arabidopsis thaliana (documento WO 01/96580, documento WO 03/050287) , y Dendrobium sp. (Yang et al., J. Exp. Bot., 53, 1899-1907) . La manipulaciïn de la expresiïn del gen CKX se emplea como una herramienta poderosa para estudiar la importancia de las citoquininas de tipo iP y Z durante el ciclo vital de plantas superiores; en particular, la manipulaciïn de la expresiïn de CKX permite determinar la influencia de la citoquinina sobre el crecimiento de las raïces y el desarrollo y la morfologïa de brotes, sobre el tamaïo de las semillas y sobre la senescencia de las hojas (documento WO 01/96580; documento WO 03/050287; Werner et al., Plant Cell, 15, 2632-2550, 2003) . Los transformantes que muestran una expresiïn de ARNm de AtCKX constitutiva y una mayor actividad citoquinina oxidasa manifiestan una mayor formaciïn y crecimiento de las raïces. Tambiïn se observaron efectos negativos sobre el crecimiento de brotes.

Se ha postulado que las citoquininas desempeïan un papel fundamental en el maïz para establecer el tamaïo de las semillas, disminuir el aborto de la punta del grano, y aumentar la fecundaciïn de las semillas durante condiciones ambientales desfavorables (documento WO 00/63401) . Smigocki et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5131-5135, 1988) han observado una mayor organogïnesis de brotes tras la infecciïn de tallos, trozos de hojas y plïntulas con Agrobacterium tumefaciens que sobreexpresa la isopenteniltransferasa (ipt) . Por tanto, tambiïn se ha postulado que unos mayores niveles de citoquininas en la semilla proporcionarïn un mayor tamaïo de las semillas y una mayor fertilizaciïn de las semillas (documento WO 00/63401) . El mismo punto de partida se empleï en los documentos US 2004/237147 y WO 2005/097824, obteniïndose un mayor rendimiento de semillas mediante la sobreexpresiïn de una proteïna de isopenteniltransferasa. A lo largo de las mismas lïneas, en el documento WO 2004/044200, se ha predicho que una deleciïn funcional de la citoquinina oxidasa mejorarïa el rendimiento de semillas en plantas, y en particular en el arroz.

En la tïcnica se sabe que la expresiïn de CKX constitutiva en una planta conduce a aumentar el crecimiento radical, pero disminuye el crecimiento de brotes (documento WO 01/96580) . Tambiïn se ha desmostrado que la expresiïn de CKX bajo el control de un promotor constitutivo fuerte en una planta da como resultado un mayor tamaïo de las semillas, un mayor tamaïo del embriïn y un mayor tamaïo de los cotiledones (documento WO 03/050287) . Sin embargo, no se sabe quï partes de la semilla serïan las mïs adecuadas para la expresiïn de CKX para lograr un mayor rendimiento de semillas. Los inventores ahora han demostrado, por primera vez, que puede obtenerse un mayor rendimiento de semillas con relaciïn a plantas control cuando la citoquinina oxidasa (CKX) , y en particular la citoquinina oxidasa 2 (CKX2) se sobreexpresa en ciertas partes de la semilla, concretamente la aleurona y/o el embriïn. Los inventores tambiïn han demostrado que la sobreexpresiïn de CKX2 especïfica de la aleurona y/o del embriïn conduce a un aumento mayor en el rendimiento de semillas, comparado con la sobreexpresiïn... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para aumentar el nïmero de semillas llenas de una planta, consistiendo dicho procedimiento en (i) introducir en una cïlula vegetal una molïcula de ïcido nucleico aislada que codifica una citoquinina oxidasa unida operablemente a un promotor que dirige especïficamente la expresiïn en el embriïn y/o la aleurona de una semilla, y (ii) aumentar el nivel y/o la actividad de dicha citoquinina oxidasa en el embriïn y/o la aleurona de la semilla de una planta, en el que dicha molïcula de ïcido nucleico aislada que codifica una citoquinina oxidasa es un ïcido nucleico que codifica la proteïna representada por SEQ ID NO:36, o es una molïcula de ïcido nucleico que codifica CKX2 que se hibrida especïficamente en 0, 1 a 1x SSC y SDS al 0, 1% en p/v a 60 ïC con dicho ïcido nucleico que codifica la proteïna de SEQ ID NO:36, y en el que dicho promotor comprende los nucleïtidos 1-1256 de SEQ ID NO:41.

2. Un procedimiento de producciïn de una planta que tiene un mayor nïmero de semillas llenas y una mayor expresiïn de una citoquinia oxidasa en el embriïn y/o la aleurona de una semilla, consistiendo dicho procedimiento en (i) introducir en una cïlula vegetal una molïcula de ïcido nucleico aislada que codifica una citoquinina oxidasa unida operablemente a un promotor que dirige especïficamente la expresiïn en el embriïn y/o la aleurona de una semilla, y (ii) aumentar el nivel y/o la actividad de dicha citoquinina oxidasa en el embriïn y/o la aleurona de la semilla de una planta, en el que dicha molïcula de ïcido nucleico aislada que codifica una citoquinina oxidasa es un ïcido nucleico que codifica la proteïna representada por SEQ ID NO:36, o es una molïcula de ïcido nucleico que codifica CKX2 que se hibrida especïficamente en 0, 1 a 1x SSC y SDS al 0, 1% en p/v a 60 ïC con dicho ïcido nucleico que codifica la proteïna de SEQ ID NO:36, y en el que dicho promotor comprende los nucleïtidos 1-1256 de SEQ ID NO:41.

3. Un procedimiento de producciïn de una planta que tiene un mayor nïmero de semillas llenas, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) introducir en una cïlula vegetal una construcciïn genïtica que comprende un ïcido nucleico aislado que codifica una citoquinina oxidasa unida operablemente a un promotor que dirige la expresiïn especïficamente en el embriïn y/o la aleurona de una semilla, en el que dicha molïcula de ïcido nucleico aislada que codifica una citoquinina oxidasa es un ïcido nucleico que codifica la proteïna representada por SEQ ID NO:36, o es una molïcula de ïcido nucleico que codifica CKX2 que se hibrida especïficamente en 0, 1 a 1x SSC y SDS al 0, 1% en p/v a 60 ïC con dicho ïcido nucleico que codifica la proteïna de SEQ ID NO:36, y en el que dicho promotor comprende los nucleïtidos 1-1256 de SEQ ID NO:41;

(b) regenerar una planta a partir de esta;

(c) hacer crecer la planta regenerada hasta la fecundaciïn de la semilla; y

(d) seleccionar una planta con un mayor nïmero de semillas llenas, comparado con una correspondiente planta de tipo salvaje.

4. El uso de SEQ ID NO:41 para aumentar el nïmero de semillas llenas de una planta.