Métodos y vectores que generan inmunoglobulinas sialiladas.

Un método para proporcionar un actividad enzimática de la sialidasa en un cultivo que comprende células de mamífero modificadas para expresar una molécula que contiene Fc,

por el que los glicanos de la molécula que contiene Fc pueden actuar por la actividad enzimática de la sialidasa del polipéptido, comprendiendo la transfección de la célula modificada de mamífero con un vector que codifica el dominio catalítico de la enzima A de la sialidasa Arthrobacter ureafaciens, en el que el polipéptido se secreta en el cultivo junto a la molécula que contiene Fc.

Métodos y vectores que generan inmunoglobulinas sialiladas

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención [0001] La invención se refiere a métodos de producción de proteínas terapéuticas que interactúan con receptores Fc, por ejemplo, anticuerpos, en los que la composición de las cadenas oligosacáridas están optimizadas para la severidad del anticuerpo para su diana, así como para la afinidad de unión al receptor Fc optimizando la actividad de la función efectora de dichos anticuerpos en comparación con métodos no optimizados de producción de anticuerpos glicosilados.

Descripción de trabajos relacionados [0002] Los anticuerpos son glicoproteínas de suero solubles que desempeñan un papel importante en la inmunidad innata. Las estructuras de hidratos de carbono de todos los anticuerpos producidos de forma natural en las posiciones conservadas en las regiones constantes de cadena pesada varían según el isotipo. Cada isotipo posee una matriz distinta de estructuras de oligosacáridos N ligados, que afectan variablemente a la unión de proteínas y a la actividad secretora o funcional (Wright, A., y Morrison, SL, Trends Biotech. 15: 26 - 32 (1997) ) . Haciendo referencia a las Figs. 1 y 2, la estructura de los oligosacáridos N ligados varía considerablemente, dependiendo del grado de procesamiento, y puede incluir un alto contenido en manosa, así como oligosacáridos biantenarios complejos con o sin bisectriz GlcNAc y residuos de fucosa de núcleo (Wright, A., y Morrison, SL, supra) . Normalmente, el procesamiento heterogéneo se da en las estructuras del núcleo de oligosacáridos unidos a un sitio de glicosilación particular, de tal manera que existen incluso anticuerpos monoclonales con múltiples glicoformas. Del mismo modo, se ha demostrado que las principales diferencias en la glicosilación de anticuerpos se producen entre las líneas celulares productoras de anticuerpos, e incluso se han visto diferencias menores para una línea celular dada crecido en diferentes condiciones de cultivo.

El ácido siálico en los glicanos (grupos estáticos) son conocidos por ser importantes en la prolongación de la semivida en suero de las glicoproteínas que no son anticuerpos (Stockert, RJ (1995) Physiol. Rev. 75, 591 - 609) . Hasta ahora, el papel del ácido siálico en los anticuerpos monoclonales (mAbs) no se comprendía bien. La semivida en suero de los anticuerpos monoclonales es particularmente larga y se ha demostrado que la construcción de proteínas de fusión con Fc es una estrategia útil en el desarrollo de proteínas terapéuticas, por ejemplo, la proteína enteracept.

Los anticuerpos y moléculas receptoras de células T poseen regiones responsables de la unión al receptor de superficie celular específico, cuya unión modula la respuesta celular. En el sistema inmune, estas funciones se clasifican como humoral y celular. Los anticuerpos se denominan a menudo moléculas adaptadoras que se unen mecanismos inmunes humorales y celulares: las respuestas humorales se atribuyen principalmente a anticuerpo circulantes, maduros y secretados capaces de unirse con alta afinidad a un antígeno diana. Las respuestas celulares se atribuyen a las consecuencias de la activación celular mediante la unión de los complejos de AB - AG y por las secuelas aguas abajo causadas por la liberación de mediadores celulares como resultado de la unión del complejo AB - AG a las células efectoras. Estas respuestas celulares incluyen la neutralización de diana, la opsonización y la sensibilización (si el antígeno se muestra en la superficie de una célula) , la sensibilización de mastocitos, y la activación del complemento. Para las dianas celulares, es decir, los antígenos de la superficie celular, estas funciones efectoras dan lugar a lo que se conoce comúnmente como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

Entre los isotipos de anticuerpos (por ejemplo, IgE, IgD, IgA, IgM e IgG) , las IgG son los más abundantes, y las subclases IgG1 que muestran el grado y la variedad de las funciones efectoras más significativos. Los anticuerpos de tipo IgG1 son los anticuerpos más utilizados comúnmente en la inmunoterapia del cáncer, donde la actividad de ADCC y de CDC a menudo se consideran importantes. Estructuralmente, las IgG de la región bisagra y los dominios CH2 desempeñan un papel importante en las funciones efectoras de anticuerpos. Los oligosacáridos N ligados presentes en la región Fc (formada por la dimerización de la bisagra, y los dominios CH2 y CH3) afectan a las funciones efectoras. Los oligosacáridos con enlaces covalentes son estructuras de tipo biantenario complejos y son muy heterogéneos (véanse las Figs. 1 y 2) . En cada dominio CH2 se encuentra un sitio de glicosilación N ligados conservado en Asn297. En el anticuerpo maduro, los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos a Asn297 se encuentran enterrados entre los dominios CH2, formando contactos extensos con la cadena principal del polipéptido. Se ha encontrado que su presencia es esencial para que el anticuerpo medie en las funciones efectoras, tales como la ADCC (Lifely, MR, et al, Glycobiology 5: 813 - 822 (1995) ;. Jefferis, R., et al, Immunol Rev. 163: 59 - 76 (1998) ; Wright, A. y Morrison, SL, supra, Scallon et al. 2006. Mol. Immunol. 44: 1524 - 1534) .

Los oligosacáridos heterogéneos que decoran el anticuerpo Fc-porción o las estructuras de derivados de anticuerpos comprendidas producidos por diversas células huésped contienen predominantemente ácido siálico, fucosa, galactosa y residuos de GlcNAc como azúcares terminales (Raju, TS, et al Glycobiology 2000 10 (5) : 477 86) . Se ha demostrado que algunos de estos azúcares terminales, en particular la galactosa expuesta, la fucosa nuclear y los residuos de GlcNAc bisecados, afectan a la estructura de la porción Fc de la molécula y, por lo tanto, altera las funciones efectoras de anticuerpos. Las funciones efectoras tales como la actividad de ADCC y de CDC que se basa en la unión a receptores de la superficie celular conocidos como receptores de Fc, así como la unión a diversos ligandos incluyendo el complemento de proteína C1q puede alterarse por la composición del glicano adjunto (Presta L. 2003. Curr Opin Struct Biol. 13 (4) : 519 - 25) . La mayoría de los glicanos N ligados en la FC no están sialilados en una medida significativa (Idusogie EE, et al. 2000. J. Immunol. 15: 164 (8) : 4178 -84) . Se conocen métodos de modificación de sialilación: Dalziel et al, 1999. Glycoconjugate journal 16: 801 - 807, patentes WO 2005 016 455 y WO99 / 54342.

Los principales estructuras que se encuentran en la IgG humana y otras IgG producidas de forma recombinante son las estructuras complejas biantenarias con o sin residuos de Gal expuestos (Fig. 1) . Hay un número de células huésped de mamífero que se utilizan actualmente para expresar anticuerpos recombinantes con fines de investigación, así como para la producción biofarmacéutica. Las especies de las células huésped de origen, así como las condiciones de cultivo pueden causar la variación de la extensión y la estructura de los glicanos adjuntos a moléculas expresadas de forma recombinante. Dos líneas celulares huésped comúnmente utilizadas para la expresión recombinante de anticuerpos son las células de ovario de hámster chino (CHO) y las células de mieloma de ratón (SP2 / 0, 653, NS0) . Mientras que las células CHO expresan anticuerpos recombinantes que están virtualmente desprovistos de ácido siálico de glicanos, los glicanos están fucosilados al 99%. Se ha demostrado que la presencia de fucosa es un contribuyente importante para el receptor de Fc-gammaIII reducido y, por lo tanto, de ADCC. Las células de mieloma de ratón expresan anticuerpos recombinantes con hasta un 50 % de ácido siálico, pero con, generalmente, menos fucosa. Como se ha indicado anteriormente, estas diferencias pueden tener efectos significativos en la actividad del anticuerpo in vivo.

Por tanto, sería deseable poder reducir la sialilación de glicanos asociados a los anticuerpos terapéuticos de manera que se eliminara la necesidad de un procesamiento posterior a la recogida y, al mismo tiempo, proporcionara una estructura razonablemente homogénea con respecto al contenido en ácido siálico. Las enzimas modificadoras de la sialilación se han discutido previamente, por ejemplo Ngangtung de 2005, de la Universidad de Minnesota.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención presenta un método para proporcionar una actividad enzimática de la sialidasa en un cultivo que comprende una célula de mamífero modificada genéticamente para expresar una molécula que contiene F, a través de la cual los glicanos de la molécula que contiene Fc... [Seguir leyendo]

1. Un método para proporcionar un actividad enzimática de la sialidasa en un cultivo que comprende células de mamífero modificadas para expresar una molécula que contiene Fc, por el que los glicanos de la molécula que contiene Fc pueden actuar por la actividad enzimática de la sialidasa del polipéptido, comprendiendo la transfección de la célula modificada de mamífero con un vector que codifica el dominio catalítico de la enzima A de la sialidasa Arthrobacter ureafaciens, en el que el polipéptido se secreta en el cultivo junto a la molécula que contiene Fc.

2. Un método para controlar las propiedades de una molécula que contiene Fc expresada en una línea celular, comprendiendo la reducción de la sialilación de los oligosacáridos en la región Fc mediante la transfectación de la línea celular con un vector que codifica el dominio catalítico de la enzima A de la sialidasa Arthrobacter ureafaciens, en el que la molécula que contiene Fc expresada comprende una cantidad reducida de residuos de ácido siálico, en el que las propiedades de la molécula que contiene Fc controlada tienen la avidez de la molécula para para multiplicar proteínas diana localizadas; la afinidad de uno o más receptores gamma Fc de FcγRI, FcγRII, y FcγRIIIA; la actividad ADCC; la activación de macrófagos o monocitos; y semivida del suero.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la molécula que contiene Fc es un anticuerpo y la línea celular de mamífero se selecciona del grupo formado por COS - 1, COS - 7, HEK293, BHK21, CHO, BSC - 1, Hep G2, 653, SP2 / 0, 293, HeLa, YB2 / 0 o Y3, células de mieloma o linfoma, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti – FNT α y la línea celular es C168M.

5. El método de la reivindicación 2, en el que la molécula que contiene Fc tiene un dominio de unión específico para una diana, dicha diana:

(i) es una diana inmovilizada; o

(ii) se expresa en la superficie de una célula

6. Un vector de expresión que comprende una secuencia nucleótida que codifica la enzima A de la sialidasa Arthrobacter ureafaciens, en el que el vector es capaz de expresar un polipéptido que tiene una actividad enzimática de la sialidasa en un cultivo de células de mamíferos que expresa una molécula que contiene Fc.

7. El vector de la reivindicación 6, en el que la línea celular de mamífero se selecciona del grupo formado por COS - 1, COS - 7, HEK293, BHK21, CHO, BSC - 1, Hep G2, 653, SP2 / 0, 293, HeLa, YB2 / 0 o Y3, células de mieloma o linfoma, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas.

8. El vector de la reivindicación 6, en el que el vector comprende:

(i) una secuencia de señal, por ejemplo una secuencia de señal de la hormona del crecimiento humano;

(ii) una secuencia promotora, por ejemplo una secuencia promotora CMV; y

(iii) una resistencia antibiótica, por ejemplo neomicina.

9. Un método para producir una molécula que contiene Fc que comprende el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 – 5.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la molécula que contiene Fc es un anticuerpo.