Métodos para supervisar las condiciones por análisis de secuencia.

Un método para determinar un perfil de secuencias de ADN recombinado en linfocitos T y/o linfocitos B que comprende:

(a) obtener una muestra de un sujeto que comprende linfocitos T y/o linfocitos B;

(b) aislar espacialmente moléculas individuales de ácido nucleico de dichas células en un sustrato sólido;

(c) secuenciar dichas moléculas individuales aisladas espacialmente de ácido nucleico secuenciando por síntesis usando nucleótidos marcados en el extremo de forma reversible, pirosecuenciación, secuenciación 454, hibridación específica de alelo con una biblioteca de sondas oligonucleotídicas marcadas, secuenciación por síntesis usando hibridación específica de alelo con una biblioteca de clones marcados que se sigue de ligación, control en tiempo real de la incorporación de nucleótidos marcados durante una etapa de polimerización, secuenciación de polonias o secuenciación SOLID; y

(d) determinar los niveles de las diferentes secuencias de dicha muestra para generar dicho perfil de secuencias de ADN recombinado.

Métodos para supervisar las condiciones por análisis de secuencia

Antecedentes de la invención El sistema inmunitario comprende los sistemas inmunitarios innato y adaptativo. El sistema inmunitario innato comprende las células y mecanismos que utilizan métodos genéricos para reconocer patógenos ajenos. Las células implicadas en inmunidad innata incluyen neutrófilos, linfocitos citolíticos naturales, macrófagos, monocitos, basófilos,

eosinófilos, mastocitos y células dendríticas. Estas células llevan a cabo el acto de la fagocitosis así como la liberación de muchos productos químicos que destruyen patógenos invasores. Además, estas células están implicadas en mecanismos de defensa de inmunidad innata incluyendo la cascada del complemento e inflamación. Finalmente, algunas de estas células participan en el proceso de presentación de antígenos que desempeña un papel en el sistema inmunitario adaptativo.

El sistema inmunitario adaptativo ha evolucionado para atacar elementos específicos en sus dianas. La aparición de una respuesta a una diana específica proporciona al hospedador “memoria” de ella, provocando que monte una respuesta más fuerte si volviera a aparecer en otro momento. Habitualmente cualquier proteína o polisacárido puede actuar como la diana para algún subconjunto de las células de respuesta inmunitaria adaptativa o sus productos que reconocen epítopos específicos en la diana. La respuesta inmunitaria adaptativa se divide en dos tipos: la respuesta inmunitaria humoral y la mediada por células, y los linfocitos B y linfocitos T desempeñan los papeles de especificidad en estas respuestas, respectivamente.

Puesto que la enfermedad autoinmunitaria implica el reconocimiento de algún elemento del sistema inmunitario adaptativo a dianas propias, se han examinado aspectos del sistema inmunitario adaptativo para ayudar en el diagnóstico o pronóstico. Usando técnicas inmunológicas convencionales, el sistema inmunitario humoral se ha investigado buscando autoanticuerpos en circulación. Se han identificado autoanticuerpos como antinucleares, anti ADNbc y factor reumatoide para varias enfermedades. Estos anticuerpos pueden no ser en sí mismos patológicos, ni es la diana que reconocen en el cuerpo necesariamente la misma que la ensayada in vitro, sin embargo, la medición de sus niveles ayuda en el diagnóstico y en algunos casos tiene algunas implicaciones de pronóstico y tratamiento.

Otra metodología para estudiar el sistema inmunitario adaptativo en enfermedad autoinmunitaria se basa en el análisis de la diversidad de las células inmunitarias adaptativas. La activación de las células inmunitarias adaptativas conduce a su expansión clonal. Se consiguen habitualmente pruebas de esta expansión clonal mediante 35 amplificación del ARN o ADN sanguíneo de parte de la secuencia de ácido nucleico que codifica la región de reconocimiento de antígenos. Por ejemplo, se usan cebadores de PCR para amplificar secuencias que tienen un segmento V específico de la cadena ! en el receptor de linfocitos T (análogo a la cadena pesada de anticuerpo) para amplificar los segmentos J o segmentos J y D conectados con el segmento V específico, Cuando está presente una población celular diversa, se espera que amplifique fragmentos con una distribución de amplicones de tamaño ligeramente diferente, pero la expansión clonal provoca que se enriquezcan tamaños específicos y por lo tanto sean más intensos al visualizarse como bandas en un gel. En la técnica denominada espectrotipificación cada uno de los segmentos V se amplifica con los segmentos J y D para evaluar si alguno de estos amplicones muestra una expansión clonal.

Un problema del enfoque de espectrotipación es que muchas secuencias distintas pueden tener la misma longitud y por lo tanto son indistinguibles. Por lo tanto solamente puede determinarse expansión clonal drástica por esta técnica. Experimental Hematology (2007) vol. 35, páginas 831-841 desvela la identificación del repertorio de TCR por hibridación con matrices de sondas específicas de J o V; sin embargo, dicha técnica no permite la identificación específica de secuencia de un perfil de secuencias J-V recombinadas y su cuantificación.

Existe la necesidad de mejorar métodos para diagnosticar y ayudar al pronóstico de enfermedad autoinmunitaria y patologías autoinmunitarias así como otras enfermedades para las que el sistema inmunitario desempeña un papel central.

Aunque la especificidad adicional en la realización del perfil del sistema inmunitario sería muy útil al permitir que se 55 prediga mejor su impacto en la salud humana, se proporcionaría aún más utilidad si se desarrollaran métodos que permitieran que los linfocitos T y B específicos implicados en procesos de enfermedad se identifiquen incluso si esas secuencias particulares nunca se habían observado antes. La amplia diversidad del sistema inmunitario le proporciona una reserva inmensa de células potencialmente útiles pero también presenta un reto al investigador que intenta usar este repertorio para fines predictivos. Cualquier secuencia individual que se dirige a un antígeno es una 60 de un amplio número que podría estar implicado con y/o correlacionarse con el proceso de enfermedad en un individuo dado. Los métodos que identificaran cuáles de las muchas células en un individuo dado están implicadas en procesos de enfermedad serían muy valiosos para la salud humana.

Sumario de la invención En un aspecto, se proporciona un método para determinar un perfil de secuencias de ADN recombinadas en linfocitos T y/o linfocitos B que comprende: obtener una muestra de un sujeto que comprende linfocitos T y/o linfocitos B, aislar espacialmente moléculas individuales de ADN genómico de dichas células; secuenciar dichas moléculas individuales aisladas espacialmente de ADN genómico, y determinar los niveles de secuencias diferentes de dicha muestra para generar dicho perfil de secuencias de ADN recombinado.

En otro aspecto, se proporciona un método para determinar un perfil de secuencias de ADN recombinado en linfocitos T y/o linfocitos B que comprende: obtener una muestra de un sujeto que comprende linfocitos T y/o linfocitos B, aislar espacialmente moléculas individuales de ADN genómico de dichas células, amplificar dichas moléculas individuales de ADN genómico, secuenciar dicho ADN amplificado y determinar los niveles de secuencias diferentes de dicha muestra para generar dicho perfil de secuencias de ADN recombinado.

En otro aspecto, se proporciona un método para determinar un perfil de secuencias de ADN recombinado en linfocitos T y/o linfocitos B que comprende: obtener una muestra de un sujeto que comprende linfocitos T y/o linfocitos B, amplificar ADN genómico de dichas células, aislar espacialmente moléculas individuales de dicho ADN amplificado, secuenciar dichas moléculas individuales aisladas espacialmente de ADN amplificado; y determinar los niveles de secuencias diferentes de dicha muestra para generar dicho perfil de secuencias de ADN recombinado.

En otro aspecto, se proporciona un método para determinar un perfil de secuencias de ADN recombinado en linfocitos T y/o linfocitos B que comprende: obtener una muestra de un sujeto que comprende linfocitos T y/o linfocitos B, amplificar ADN genómico de dichas células, aislar espacialmente moléculas individuales de dicho ADN amplificado, volver a amplificar dichas moléculas de ADN amplificado, secuenciar dichas moléculas de ADN que se ha vuelto a amplificar, y determinar los niveles de secuencias diferentes de dicha muestra para generar dicho perfil de secuencias de ADN recombinado.

En otro aspecto, se proporciona un método para determinar un perfil de secuencias de ADN recombinado en linfocitos T y/o linfocitos B que comprende: obtener una muestra de un sujeto que comprende linfocitos T y/o linfocitos B, transcribir de forma inversa ARN de dichas células para formar ADNc, aislar espacialmente moléculas individuales de dicho ADNc, volver a amplificar opcionalmente dichas moléculas individuales aisladas espacialmente de ADNc, secuenciar dicho ADNc y/o ADNc reamplificado; y determinar los niveles de diferentes secuencias de dicha muestra para generar dicho perfil de secuencias de ADN recombinado.

En otro aspecto, se proporciona un método para determinar un perfil de secuencias de ADN recombinado en linfocitos T y/o linfocitos B que comprende: obtener una muestra de un sujeto que comprende linfocitos T y/o linfocitos B, aislar espacialmente células individuales en dicha muestra, secuenciar moléculas individuales de ácido nucleico de dichas células; y determinar los niveles de diferentes secuencias a partir de dicha muestra para generar dicho perfil de secuencias... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar un perfil de secuencias de ADN recombinado en linfocitos T y/o linfocitos B que comprende:

(a) obtener una muestra de un sujeto que comprende linfocitos T y/o linfocitos B;

(b) aislar espacialmente moléculas individuales de ácido nucleico de dichas células en un sustrato sólido;

(c) secuenciar dichas moléculas individuales aisladas espacialmente de ácido nucleico secuenciando por síntesis usando nucleótidos marcados en el extremo de forma reversible, pirosecuenciación, secuenciación 454, hibridación específica de alelo con una biblioteca de sondas oligonucleotídicas marcadas, secuenciación por síntesis usando hibridación específica de alelo con una biblioteca de clones marcados que se sigue de ligación, control en tiempo real de la incorporación de nucleótidos marcados durante una etapa de polimerización, secuenciación de polonias o secuenciación SOLID; y

(d) determinar los niveles de las diferentes secuencias de dicha muestra para generar dicho perfil de secuencias de ADN recombinado.

2. El método de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico es ADN genómico.

3. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde el sustrato sólido se proporciona por un portaobjetos de vidrio o perlas.

4. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde las moléculas de ácido nucleico se amplifican.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dichos linfocitos T y/o linfocitos B comprenden un subconjunto de linfocitos T y/o linfocitos B.

6. El método de la reivindicación 5, donde dicho subconjunto de linfocitos T y/o linfocitos B se enriquece por interacción con un marcador de superficie celular.

7. Un método para determinar uno o más clonotipos correlacionados de una enfermedad en un sujeto que comprende:

(a) generar uno o más perfiles de clonotipo de al menos dos muestras, donde cada perfil se genera por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y donde al menos una muestra está relacionada con un primer estado de la enfermedad, y

(b) determinar uno o más clonotipos correlacionados en el sujeto basándose en la comparación de un perfil de clonotipo de la al menos una muestra con uno o más perfiles de clonotipo de al menos otra muestra.

8. El método de la reivindicación 7, donde dicha al menos una muestra es de un tejido afectado por la enfermedad.

9. El método de la reivindicación 7 o reivindicación 8, donde la enfermedad es lupus eritematoso sistémico o esclerosis múltiple.