Métodos para producir anticuerpos a partir de células plasmáticas.

Método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas que comprende:

cultivar las células plasmáticas en presencia de IL-6 o células estromales mesenquimales en un número limitado y obtener dicho anticuerpo a partir de éstas, siendo el número de células plasmáticas cultivadas igual a 10 o inferior

Métodos para producir anticuerpos a partir de células plasmáticas.

ANTECEDENTES

Las células plasmáticas son células terminalmente diferenciadas, no proliferantes, que segregan anticuerpos a gran velocidad (miles de moléculas por segundo, correspondientes a aproximadamente 30-50 pg por célula al día) . 5

Minges Wols y col. (Minges Wols y col., The J. of Immunology 2002, 169: 4213-4221) describen el papel de las células estromales derivadas de médula ósea en el mantenimiento de la longevidad de las células plasmáticas. Los autores suponen en su estudio que las células plasmáticas de médula ósea no tienen intrínsecamente una larga vida, sino que las células plasmáticas entran en contacto con las células estromales de médula ósea y las modifican para proporcionar factores de supervivencia. 10

También se ha comprobado que la supervivencia de las células plasmáticas está influenciada por efectos sinérgicos de citoquinas y señales dependientes de la adhesión (Cassese y col., The Journal of Immunology, 2003, 171: 1684-1690) .

El aislamiento de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monoclonales, a partir de células plasmáticas se basa en la clonación y expresión de los genes de inmunoglobulina. Esto se puede llevar a cabo utilizando bibliotecas phage 15 display de genes VH y VL aleatorizados aislados de células plasmáticas o mediante aislamiento de pares de genes VH y VL de células plasmáticas individuales utilizando PCR de células individual. Sin embargo, con el fin de seleccionar los anticuerpos producidos por células plasmáticas es necesario clonar los genes de inmunoglobulina y expresar éstos en una forma recombinante con el fin de determinar la especificidad y las propiedades funcionales del anticuerpo codificado. Este método es incómodo, costoso, requiere mucho tiempo, no es adaptable a una alta 20 capacidad de procesamiento y es ineficaz para recuperar anticuerpos raros producidos por una fracción menor del repertorio total de células plasmáticas.

Por consiguiente, existe la necesidad de identificar un método más eficiente adaptable a una alta capacidad de procesamiento para el aislamiento y la selección de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monoclonales, a partir de células plasmáticas. 25

SUMARIO

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de un método eficiente y con alta capacidad de procesamiento para producir anticuerpos a partir de células plasmáticas que permite caracterizar los anticuerpos sin acudir a la clonación y expresión de los genes de inmunoglobulina. Los anticuerpos producidos utilizando la presente invención se pueden caracterizar mediante la realización de múltiples selecciones, incluyendo ensayos de unión, funcionales 30 y/o de neutralización. La invención proporciona un método para la identificación de anticuerpos raros producidos por células plasmáticas.

Así, en un aspecto de la invención, ésta proporciona un método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas que consiste en cultivar las células plasmáticas en un número limitado. En una realización, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo monoclonal a partir de células plasmáticas que incluye cultivar 35 las células plasmáticas en cultivos de células individuales. Los métodos de la invención pueden incluir además la caracterización de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. La caracterización de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo incluye, sin limitarse a, la realización de ensayos funcionales para determinar la función del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo, ensayos de unión para determinar la especificidad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo o el epitopo reconocido por el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y/o ensayos de neutralización 40 para determinar la capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para neutralizar una toxina o un patógeno.

En otra realización, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. El método consiste en cultivar un número limitado de células plasmáticas, identificar aquellos cultivos que producen un anticuerpo con las características deseadas, aislar ácido nucleico que codifica el anticuerpo producido y expresar el ácido nucleico en una célula huésped. 45

En otro aspecto de la invención, ésta proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de anticuerpo producido mediante un método de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: muestra la producción acumulativa de IgG por células plasmáticas CD138+ aisladas de sangre periférica y cultivadas sobre monocapas de células estromales mesenquimales durante 50 días. 50

Figura 2: muestra la producción acumulativa de IgG por células plasmáticas CD138+ en cultivos que contienen células plasmáticas individuales aisladas de (A) sangre periférica y (B) médula ósea.

Figura 3: muestra los resultados de los análisis el día 10 de sobrenadantes de células plasmáticas CD138-alto aisladas de sangre periférica y cultivadas sobre monocapas de células estromales mesenquimales para detectar la presencia de IgG, IgA, IgM e IgE. 5

Figura 4: muestra la eficiencia del cultivo en placas de células secretoras de anticuerpos (ASC) que producen IgG, IgA o IgM cuando son cultivadas sobre células hMSC-TERT, expresada como porcentaje de células plasmáticas que sobreviven durante un tiempo suficiente para producir cantidades detectables de anticuerpos en el sobrenadante.

Figura 5: muestra la identificación de células plasmáticas que secretan IgG específica de toxoide tetánico a 10 partir de células plasmáticas aisladas de sangre periférica recogida 7 días después de una dosis de inmunización con toxoide tetánico (TT) .

Figura 6: muestra la unión al toxoide tetánico de un anticuerpo recombinante producido mediante clonación y expresión de genes VH y VL recuperados de una célula plasmática cultivada aislada de la sangre de un donante 10 años después de la vacunación con toxoide tetánico. 15

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención se basa en el descubrimiento de un método eficiente y de alto rendimiento para producir anticuerpos a partir de células plasmáticas que permite caracterizar los anticuerpos sin acudir a la clonación y expresión de los genes de inmunoglobulina. En un aspecto, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas que comprende cultivar las células plasmáticas en número limitado. Los anticuerpos 20 producidos utilizando la presente invención se pueden caracterizar convenientemente con múltiples selecciones, incluyendo ensayos de unión, funcionales y/o de neutralización, y dicha caracterización se puede realizar incluso in situ, es decir, en los pocillos donde se han cultivado las células plasmáticas.

Tal como se utiliza aquí, el concepto "célula plasmática" incluye todas las células secretoras de anticuerpos (ASC) primarias que se encuentran en sangre periférica, médula ósea, tejidos o fluidos corporales, o que se generan in 25 vitro a partir de células B. Recientemente, las células plasmáticas generadas se denominan "plasmablastos". En general, los plasmablastos generados de forma natural se encuentran en la sangre, en particular en sangre periférica. También es posible generar plasmablastos in vitro mediante la estimulación de células B con diversos estímulos, incluyendo activadores policlonales tales como agonistas de TLR. Aquí se debe considerar que el concepto "célula plasmática" o "células plasmáticas" incluye tanto "células plasmáticas" como "plasmablastos" y 30 ASC.

Teóricamente, en el medio de cultivo se puede cultivar cualquier número de células plasmáticas para producir e identificar un anticuerpo de características deseadas. En la práctica, el número de células plasmáticas que puede cultivarse está limitado por la tecnología disponible para clonar y expresar las múltiples secuencias de genes VH y VL y sus combinaciones presentes en el cultivo de células policlonales. En una realización, el concepto "número 35 limitado de células plasmáticas" se refiere a un número de células plasmáticas que es aproximadamente 100 o inferior, por ejemplo 90 o menos, 80 o menos, 70 o menos, 60 o menos, 50 o menos, 45 o menos, 40 o menos, 35 o menos, 30 o menos, 25 o menos, 20 o menos, 17 o menos, 15 o menos, 12 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos, o 1...

En una realización, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas 40 que incluye cultivar las células plasmáticas... [Seguir leyendo]

1. Método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas que comprende: cultivar las células plasmáticas en presencia de IL-6 o células estromales mesenquimales en un número limitado y obtener dicho anticuerpo a partir de éstas, siendo el número de células plasmáticas cultivadas igual a 10 o inferior.

2. Método para producir un anticuerpo monoclonal a partir de células plasmáticas que comprende: cultivar las 5 células plasmáticas en presencia de IL-6 o células estromales mesenquimales en cultivos de células individuales y obtener dicho anticuerpo a partir de éstas.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano y las células plasmáticas son células plasmáticas humanas.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque las células plasmáticas se 10 cultivan en un medio de cultivo que incluye IL-6 o células estromales mesenquimales que prolongan la supervivencia de las células plasmáticas durante un tiempo suficiente para producir el anticuerpo en las cantidades necesarias para la caracterización de dicho anticuerpo.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque la supervivencia de las células plasmáticas se prolonga durante un corto plazo, siendo dicho corto plazo de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 15 días.

6. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque la supervivencia de las células plasmáticas se prolonga durante un largo plazo, siendo dicho largo plazo de al menos 10 días.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 6, caracterizado porque la supervivencia de las células plasmáticas se prolonga durante al menos 20 días o al menos 30 días. 20

8. Método para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que incluye los pasos de:

a. cultivar un número limitado de células plasmáticas de acuerdo con el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7;

b. identificar los cultivos que producen un anticuerpo con una característica deseada;

c. aislar el ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo; y 25

d. expresar dicho ácido nucleico en una célula huésped.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que adicionalmente incluye caracterizar el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo, comprendiendo la caracterización del anticuerpo o fragmento de anticuerpo la realización de ensayos funcionales para determinar la función del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, ensayos de unión para determinar la especificidad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo o el 30 epitopo reconocido por el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y/o ensayos de neutralización para determinar la capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para neutralizar una toxina o un patógeno.