Métodos de replegamiento de glicosiltransferasas de mamífero.

Una glicosiltransferasa eucariota recombinante que es una proteína St3Gal I,

una proteína St3GalIII o una proteína Core GalITI, en la que se delecionan una región de anclaje de tallo y un dominio transmembrana de la proteína la proteína St3GalIII, St3Gal I o la proteína Core GalITI recombinante y en la que se fusiona la proteína St3GalIII, la proteína St3GalI o la proteína Core GalITI en marco con un dominio de unión a maltosa.

Métodos de replegamiento de glicosiltransferasas de mamífero Campo de la invención La presente invención proporciona métodos de replegamiento de glicosiltransferasas de mamífero que se han producido en células bacterianas, incluyendo mutantes de glicosiltransferasa que tienen una capacidad mejorada para replegarse, y métodos para usar tales glicosiltransferasas replegadas. La invención también proporciona métodos de replegamiento de más de una glicosiltransferasa en un único recipiente, métodos para usar tales glicosiltransferasas replegadas, y mezclas de reacción que comprenden las glicosiltransferasas replegadas.

Antecedentes de la invención Los organismos eucariotas sintetizan estructuras de oligosacárido o glicoconjugados, tales como glicolípidos o glicoproteínas, que son comercial y terapéuticamente útiles. La síntesis in vitro de oligosacáridos o glicoconjugados puede llevarse a cabo usando glicosiltransferasas eucariotas recombinantes. El método más eficaz para producir glicosiltransferasas eucariotas recombinantes para la síntesis de oligosacáridos es expresar la proteína en bacterias. Sin embargo, en bacterias, muchas glicosiltransferasas eucariotas se expresan como proteínas insolubles en cuerpos de inclusión bacterianos, y los rendimientos de proteína activa a partir de los cuerpos de inclusión pueden ser muy bajos, Por tanto, existe la necesidad de métodos mejorados para producir glicosiltransferasas eucariotas en bacterias. La presente invención resuelve esta y otras necesidades.

Breve sumario de la invención La presente invención se refiere a una glicosiltransferasa eucariota recombinante y a un método de replegamiento de una glicosiltransferasa eucariota recombinante insoluble según las reivindicaciones adjuntas. La presente invención proporciona un método de replegamiento de una glicosiltransferasa eucariota, recombinante, insoluble que comprende un dominio de proteína de unión a maltosa (MBD) . La glicosiltransferasa eucariota, recombinante, insoluble se solubiliza en un tampón de solubilización y entonces se pone en contacto con un tampón de replegamiento que comprende un par redox, de manera que la glicosiltransferasa eucariota replegada cataliza la transferencia de un azúcar de un sustrato donador a un sustrato aceptor. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota se trunca para eliminar la totalidad o una parte de una región de tallo de la proteína. En una realización adicional, se elimina una cisteína desapareada en la glicosiltransferasa eucariota mediante sustitución por un aminoácido distinto de cisteína y la glicosiltransferasa eucariota también se trunca para eliminar la totalidad o una parte de una región de tallo de la proteína.

La glicosiltransferasa eucariota se selecciona del grupo que consiste en StIII Gal3, ST3GalI y Core GalITI.

En una realización, la glicosiltransferasa eucariota comprende además un dominio de purificación, por ejemplo, un dominio de unión a almidón (SBD) , un dominio de tiorredoxina, un dominio SUMO, un dominio de poli-His, un dominio de epítopo myc y un dominio de glutatión-S-transferasa.

En una realización, la glicosiltransferasa eucariota comprende además un dominio de autoescisión.

En una realización, la glicosiltransferasa eucariota se expresa en una célula huésped bacteriana como un cuerpo de inclusión insoluble.

En una realización, una segunda glicosiltransferasa eucariota recombinante, insoluble se repliega con la primera glicosiltransferasa eucariota. En una realización adicional, una tercera glicosiltransferasa eucariota recombinante, insoluble se repliega con la primera glicosiltransferasa eucariota y la segunda glicosiltransferasa eucariota. Puede añadirse una glicosiltransferasa eucariota recombinante, insoluble adicional y replegarse juntas dependiendo de las necesidades del usuario, por ejemplo, replegamiento de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 glicosiltransferasas juntas.

En una realización, el par redox se selecciona del grupo que consiste en glutatión reducido/glutatión oxidado (GSH/GSSG) y cisteína/cistamina.

En una realización, el sustrato aceptor se selecciona de una proteína, un péptido, una glicoproteína y un glicopéptido.

En una realización, la glicosiltransferasa eucariota es una sialiltransferasa seleccionada de StIII Gal3 y ST3GalI. En un aspecto adicional, el sustrato donador es una molécula de CMP-ácido siálico-PEG y el sustrato aceptor se selecciona de una proteína, un péptido, una glicoproteína y un glicopéptido.

La presente invención también proporciona una glicosiltransferasa eucariota, recombinante, en la que se han delecionado una región de anclaje de tallo y un dominio transmembrana de la proteína, y en el que la glicosiltransferasa se fusiona en marco con un dominio de proteína de unión a maltosa (MBP) . En una realización, la fusión de la glicosiltransferasa eucariota, recombinante y el dominio de MBP se expresa como un cuerpo de inclusión insoluble en bacterias, por ejemplo, E. coli.

En una realización, se deleciona la totalidad o una parte de la región de tallo de la glicosiltransferasa eucariota, recombinante. En otra realización, se elimina una cisteína desapareada en la glicosiltransferasa eucariota, recombinante mediante sustitución por un aminoácido distinto de cisteína.

En una realización adicional, la glicosiltransferasa eucariota, recombinante es una de las siguientes: una proteína StIIIGal3, una proteína ST3GalI o una proteína Core GalITI.

En una realización, la glicosiltransferasa eucariota, recombinante es una proteína ST3GalIII. En un aspecto, la proteína ST3GalIII es una proteína ST3GalIII de rata truncada seleccionada de ST3GalIII28, ST3GalIII73, ST3GalIII85 y ST3GalIII86. En otro aspecto, la proteína ST3GalIII comprende una sustitución de aminoácido por un residuo de cisteína desapareado. En un aspecto adicional, la proteína ST3GalIII tanto está truncada como se le ha eliminado un residuo de cisteína desapareado mediante una mutación por sustitución.

En una realización, la glicosiltransferasa eucariota recombinante es una proteína Core1 GalT1. En un aspecto, la proteína Core1 GalT1 es una proteína de Drosophila truncada o una proteína humana truncada. En otro aspecto, una proteína Core1 GalT1 humana o de Drosophila comprende una sustitución de aminoácido por un residuo de cisteína desapareado. En un aspecto adicional, una proteína Core1 GalT1 humana o de Drosophila tanto está truncada como se le ha eliminado un residuo de cisteína desapareado mediante una mutación por sustitución.

En una realización, la glicosiltransferasa eucariota, recombinante es una proteína ST3Gal1. En un aspecto, la proteína ST3Gal1 es una proteína humana truncada seleccionada de ST3Gal129, ST3Gal145 y ST3Gal156. En otro aspecto, la proteína ST3Gal1 comprende una sustitución de aminoácido por un residuo de cisteína desapareado. En un aspecto adicional, la proteína ST3Gal1 tanto está truncada como se le ha eliminado un residuo de cisteína desapareado mediante una mutación por sustitución.

La presente invención también proporciona un método de remodelación de una proteína, un péptido, una glicoproteína o un glicopéptido según las reivindicaciones adjuntas usando las glicosiltransferasas eucariotas, recombinantes enumeradas anteriormente, tras haberse replegado las proteínas y tienen actividad enzimática.

La presente invención proporciona métodos mejorados para replegar glicosiltransferasas eucariotas insolubles en una forma activa y también proporciona glicosiltransferasas, por ejemplo, enzimas N-acetilglucosaminiltransferasa I (GnT1) que tienen propiedades de replegamiento mejoradas.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de replegamiento de al menos dos proteínas glicosiltransferasas eucariotas recombinantes, insolubles en un único recipiente, poniendo en contacto las glicosiltransferasas con un tampón de replegamiento que incluye un par redox. Tras el replegamiento, al menos dos de las glicosiltransferasas replegadas tienen actividad biológica, por ejemplo, pueden catalizar la transferencia de un sustrato donador a un sustrato aceptor.

El tampón de replegamiento también puede incluir un detergente, o un agente caotrópico, o arginina, o PEG. En algunas realizaciones, el pH del tampón de replegamiento es de entre 6, 0 y 10, 0. En una realización, el pH del tampón de replegamiento es de entre 6, 5 y 8, 0. En otra realización, el pH del tampón de replegamiento es de entre 8, 0 y 9, 0.

En otra realización, las glicosiltransferasas incluyen una cola de aminoácidos, por ejemplo, una proteína de unión a maltosa (MBP) , una... [Seguir leyendo]

1. Una glicosiltransferasa eucariota recombinante que es una proteína St3Gal I, una proteína St3GalIII o una proteína Core GalITI, en la que se delecionan una región de anclaje de tallo y un dominio transmembrana de la proteína la proteína St3GalIII, St3Gal I o la proteína Core GalITI recombinante y en la que se fusiona la proteína St3GalIII, la proteína St3GalI o la proteína Core GalITI en marco con un dominio de unión a maltosa.

2. La proteína St3GalIII, la proteína St3GalI o la proteína Core GalITI recombinante de la reivindicación 1, en la que se deleciona la totalidad o una parte de región de tallo.

3. La proteína St3GalIII, la proteína St3GalI o la proteína Core GalITI recombinante de la reivindicación 1, en la que se elimina una cisteína desapareada en la proteína St3GalIII, la proteína St3GalI o la proteína Core GalITI recombinante mediante sustitución por aminoácido distinto a cisteína.

4. La proteína St3GalIII de la reivindicación 1, siendo la proteína St3GalIII una proteína St3GalIII de rata truncada seleccionada de St3GalIII 28, St3GalIII 73, St3GalIII 85 y St3GalIII 86.

5. La proteína St3GalI de la reivindicación 1, siendo la proteína St3GalI una proteína St3GalI humana truncada seleccionada de St3GalI 29, St3GalI 45 y St3GalI 56.

6. Un método de remodelación de una proteína, un péptido, una glicoproteína o un glicopéptido usando la proteína St3GalIII, la proteína St3GalI o la proteína Core GalITI recombinante de la reivindicación 1.

7. Un método de replegamiento de una primera glicosiltransferasa eucariota recombinante insoluble, en el que la glicosiltransferasa comprende un dominio de proteína de unión a maltosa (MBD) , comprendiendo el método las etapas de

(a) solubilizar la glicosiltransferasa eucariota recombinante insoluble en un tampón de solubilización; y

(b) poner en contacto la glicosiltransferasa eucariota soluble con un tampón de replegamiento que comprende un par redox para replegar la glicosiltransferasa eucariota, en el que la glicosiltransferasa eucariota replegada cataliza la transferencia de un azúcar de un sustrato donador a un sustrato aceptor; en el que la primera glicosiltransferasa eucariota es St3GalIII, St3GalI o Core GalITI.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la primera glicosiltransferasa eucariota se trunca para eliminar la totalidad o una parte de una región de tallo.

9. El método de la reivindicación 7, en el que se elimina una cisteína desapareada en la primera glicosiltransferasa eucariota mediante sustitución por un aminoácido distinto de cisteína.

10. El método de la reivindicación 7, en el que la primera glicosiltransferasa eucariota comprende además un dominio de purificación seleccionado del grupo que consiste en un dominio de unión a almidón, un dominio de tiorredoxina, un dominio SUMO, un dominio de poli-His, un dominio de epítopo myc y un dominio de glutatión-S-transferasa.

11. El método de la reivindicación 7, en el que la primera glicosiltransferasa eucariota comprende además un dominio de autoescisión.

12. El método de la reivindicación 7, en el que la primera glicosiltransferasa eucariota se expresa en una célula huésped bacteriana como un cuerpo de inclusión insoluble.

13. El método de la reivindicación 7, en el que una segunda glicosiltransferasa eucariota recombinante insoluble se repliega con la primera glicosiltransferasa eucariota.

14. El método de la reivindicación 13, en el que una tercera glicosiltransferasa eucariota recombinante insoluble se repliega con la primera glicosiltransferasa eucariota y la segunda glicosiltransferasa eucariota.

15. El método de la reivindicación 7, en el que el par redox se selecciona del grupo que consiste en glutatión reducido/glutatión oxidado (GSH/GSSG) y cisteína/cistamina.

16. El método de la reivindicación 7, en el que el sustrato aceptor se selecciona de una proteína, un péptido, una glicoproteína y un glicopéptido.

17. El método de la reivindicación 7, en el que el sustrato donador es una molécula de CMP-ácido siálico-PEG y el sustrato aceptor se selecciona de una proteína, un péptido, una glicoproteína y un glicopéptido.