Método para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con RYR1.

Método para detectar una enfermedad relacionada con RyR1 seleccionada de hipertermia maligna,

enfermedad del núcleo central, enfermedad multiminicore o miopatía de bastones nemalínica en un sujeto, que incluye:

(a) el tratamiento de linfocitos aislados del sujeto con un agonista de RyR1 que es uno de 4-cloro-m-cresol, rianodina, halotano, tiopental o cafeína;

(b) la medición de los niveles de adenosina e inosina producidos por los linfocitos tratados; y,

(c) la comparación de los niveles medidos en la muestra de linfocitos tratados con los niveles de adenosina e inosina de un control normal, donde un aumento en los niveles de adenosina e inosina con respecto al control es indicativo de una enfermedad relacionada con RyR1.

Método para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con RyR1.

La presente invención surgió en parte de la investigación financiada por los números de subvención R080BS, 5 R080DN y R080DS. El gobierno puede tener ciertos derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

En el músculo esquelético, el acoplamiento excitación-contracción implica una interacción física entre dos 10 diferentes tipos de canales de Ca2+: los canales de Ca2+ dependientes de voltaje de receptores de dihidropiridina (DHPRs) localizados en el sarcolema y los canales de liberación de Ca2+ intracelular del receptor de rianodina tipo 1 (RyR1) localizados en la membrana del retículo sarcoplásmico (SR) . En respuesta a la despolarización sarcolemal, los DHPRs sufren un cambio conformacional que activa los RyR1 cercanos. La liberación masiva posterior de Ca2+ del SR en el mioplasma activa la maquinaria contráctil. La interacción mecánica DHPR-RyR1 es bidireccional dado que las 15 proteínas de RyR1 mejoran espectacularmente la capacidad de los DHPR para funcionar de forma eficaz como un canal de iones conductor de Ca2+ (Nakai et al., Nature 380:72-75 (1996) ; Dulhunty et al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 79:45-75 (2000) ) .

La relajación requiere la reabsorción dependiente de ATP de Ca2+ citosólico en el SR o la eliminación de Ca2+ en 20 el espacio extracelular por la bomba de Ca2+ sarcolemal. Debido a que los gradientes de Ca2+ a través de las membranas celulares y del SR son del orden de cuatro magnitudes, las células gastan una cantidad enorme de energía para devolver los elevados niveles de Ca2+ citoplásmico a niveles fisiológicos basales, es decir, para mantener el control de Ca2+ y la homeostasis. Este esfuerzo energético se puede revelar y cuantificar midiendo la producción de los catabolitos del ATP adenosina e inosina (Bünger, R. In: Topics and perspectives in adenosine research, pp. 223-235 25 (1987) ; Bünger, R. and S. Soboll, Eur J. Biochem 159: 203-13 (1986) ) , incluso cuando se usa un modelo de célula no contráctil tal como los linfocitos en una configuración in vitro.

Se conocen cuatro trastornos musculares y hereditarios humanos clínicamente diferentes por estar asociados a mutaciones puntuales y deleciones en el gen RyR1: hipertermia maligna (MH) , enfermedad del núcleo central (CCD) , 30 enfermedad multiminicore (MmD) y miopatía de bastones nemalínica (NM) (Jurkat-Rott, et al., J. Neurol. 249:1493-1502 (2002) ; Taratuto AL. Curr Opin. Neurol. 15:553-561 (2002) ) . Además, los síndromes musculares inducidos por calor, ejercicio y tensión pueden estar relacionados con defectos de RyR1 hasta cierto punto.

La hipertermia maligna (MH) es un síndrome farmacogenético del músculo esquelético cuyo síntoma principal es 35 una respuesta anormal a los anestésicos volátiles y a los relajantes despolarizantes del músculo esquelético. La exposición a estos agentes durante la cirugía puede desencadenar una liberación descontrolada de Ca2+ desde el SR principalmente a través de un gen RyR1 mutado que lleva a sensibilidad anormal del receptor de RyR1. La carga intracelular aumentada de Ca2+ desencadena una cascada de eventos bioquímicos que produce rigidez muscular, rabdomiólisis, arritmia cardíaca, acidosis y, finalmente, hipertermia letal. Si no se trata rápidamente mediante la retirada 40 de la anestesia y se administra dantroleno (un bloqueador de calcio intracelular) , el único medicamento disponible para el tratamiento de un episodio de MH, la mortalidad es extremadamente alta (>80%) . Síntomas de la MH iniciales pueden tener una aparición lenta, clínicamente ambigua, que hacen difícil reconocer un inminente episodio de MH. El calor, la tensión y el ejercicio son otras condiciones que pueden inducir los síntomas de tipo MH.

Actualmente, el diagnóstico definitivo de MH se hace mediante la prueba de contractura con halotano-cafeína (CHCT) invasiva que requiere cirugía en Norteamérica, mediante una prueba de contractura in vitro similar (IVCT) en Europa y por una liberación de calcio inducida por calcio técnicamente muy difícil (CICR) en Japón; todas estas pruebas usan músculo de la pierna biopsiada (Vastus lateralis) . Otros países usan pruebas esencialmente similares a una de estas pruebas. La CHCT tiene una sensibilidad del 97% (con precisión detecta individuos susceptibles de MH) con una 50 especificidad de sólo el 78% (produce un 22% de falsos positivos) . No obstante, debido a la cirugía invasiva, los costes de la prueba y la viabilidad limitada de las muestras de músculo esquelético biopsiado, la CHCT se debe completar dentro de las 5 horas posteriores a la biopsia. Por lo tanto, las biopsias musculares se deben realizar en un centro de diagnóstico para MH certificado o en hospitales cercanos (actualmente sólo hay 6 centros de diagnóstico para MH en Estados Unidos) . Debido a estas complejidades logísticas y de procedimiento, se estima que sólo aproximadamente el 55 10% de los individuos elegibles para someterse a la prueba de CHCT se realizan la prueba (estimado a partir de las referencias de la línea de asistencia para la hipertermia maligna en EE.UU.) .

La enfermedad del núcleo central (CCD) (también llamada síndrome de Shy-Magee) es una miopatía hereditaria caracterizada por debilidad de músculo proximal y deformaciones esqueléticas de los miembros inferiores (Taratuto AL. 60

Curr Opin Neurol 15:553-561 (2002) ) . El diagnóstico de la CCD se establece a través de la identificación histológica de amplias zonas amorías únicas de actividad enzimática oxidativa reducida en regiones periféricas o centrales de las fibras musculares de tipo I (es decir, núcleos centrales) . No obstante, en algunos individuos con CCD, los núcleos no están localizados centralmente, sino que se encuentran en regiones periféricas de la fibra muscular. Además, los niveles de Ca2+ en reposo aparentemente no se elevan por mutaciones de CCD que provocan el acoplamiento excitación-65

contracción, indicando que una elevación del Ca2+ en reposo no es un requisito en absoluto para la formación de núcleo (Avila et al., J. Gen. Physiol. 118:277-290 (2001) ; Avila et al., J. Gen. Physiol. 121:277-286 (2003) ) .

Variantes específicas de la enfermedad multiminicore (MmD) (Ferreiro et al., Ann. Neurol. 51:750-759 (2002) ; Jungbluth et al., Eurology, 59:284-287 (2002) ) y la miopatía de bastones nemalínica (NM) (Scacheri et al., Neurology 5 55:1689-1696 (2000) ) han mostrado recientemente que también están asociadas a mutaciones en el gen RyR1. Las biopsias de músculo esquelético de pacientes que sufren MmD muestran lesiones multifocales, mal circunscritas y de tipo núcleo corto, mientras que el músculo esquelético obtenido de individuos con NM muestra estructuras en forma de bastón cuando se visualizan utilizando la tinción con tricromo de Gomori tanto en las fibras de músculo esquelético tipo I como II. 10

Existe una coincidencia clínica significativa entre estos trastornos musculares relacionados. Por ejemplo, la CCD en fase temprana puede presentarse primero como una miopatía minicore (Ferreiro et al., Ann. Neurol. 51:750-75 (2002) , se han encontrado bastones nemalínicos adyacentes a los núcleos centrales en biopsias de algunos pacientes con CCD (Scacheri et al., Neurology 55:1689-1696 (2000) ) , y pacientes con CCD se encuentra frecuentemente que son 15 susceptibles de MH (MHS) , pero los pacientes MHS es improbable que sean CCD.

Yoshitatsu Sei et al. (ANESTHESIOLOGY. vol. 97, no. 5, noviembre 2002, páginas 1052 - 1058) demostraron que los pacientes con hipertermia maligna tienen un mecanismo de control del calcio alterado en los linfocitos B. Leslie C. McKinney et al. (ANESTHESIOLOGY. vol. 104, no. 6, junio 2006, páginas 1191 - 1201) describen la caracterización 20 de la liberación de calcio mediada por el receptor de rianodina en células B humanas. Saiid Bina et al. (FASEB J. 42 (Meeting Abstract Supplement) 991.2, 1 abril 2009) revelan que la adenosina indexa la sobrecarga de calcio inducida por un agonista de RyR1 en los linfocitos de pacientes susceptible (MHS) de hipertermia maligna (MH) . Saiid Bina et al. (ANESTHESIOLOGY IN AMERICAN SOCIETY OF ANESTHESIOLOGISTS, Annual Meeting Abstract vol. 109, 20 de octubre de 2008, página A879) divulgan una prueba diagnóstica in vitro mínimamente invasiva nueva para la hipertermia 25 maligna en humanos.

Lo que hace falta es un método menos complejo, que dure menos, que sea menos invasivo y más económico para hacer pruebas de enfermedades relacionadas con el RyR1.

Resumen de la invención

Un aspecto de la presente invención se refiere a métodos para diagnosticar enfermedades relacionadas con el canal del calcio que son enfermedades... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar una enfermedad relacionada con RyR1 seleccionada de hipertermia maligna, enfermedad del núcleo central, enfermedad multiminicore o miopatía de bastones nemalínica en un sujeto, que incluye:

(a) el tratamiento de linfocitos aislados del sujeto con un agonista de RyR1 que es uno de 4-cloro-m-cresol, rianodina, halotano, tiopental o cafeína;

(b) la medición de los niveles de adenosina e inosina producidos por los linfocitos tratados; y, 10

(c) la comparación de los niveles medidos en la muestra de linfocitos tratados con los niveles de adenosina e inosina de un control normal, donde un aumento en los niveles de adenosina e inosina con respecto al control es indicativo de una enfermedad relacionada con RyR1.

2. Método según la reivindicación 1, donde los linfocitos están en una muestra de sangre del sujeto o donde los 15 linfocitos son linfocitos de sangre periférica.

3. Método según la reivindicación 2, donde la muestra de sangre se almacena en un tubo heparinizado y los linfocitos de sangre periférica se recogen por la técnica de centrifugación de Ficoll-Hypaque.

4. Método según la reivindicación 1, donde una suspensión de los linfocitos tratados con el agonista de RyR1 se mezcla con un volumen igual de 6% de HClO4 y se centrifugada a 6.000 r.p.m. durante 10 minutos y los niveles de adenosina e inosina se analizan en el sobrenadante con HPLC.

5. Método según la reivindicación 4, donde los linfocitos se tratan con el agonista de RyR1 durante una incubación de 30 25 minutos.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde los niveles de adenosina e inosina se miden por HPLC y el control normal es una base de datos de control de diagnóstico derivada de linfocitos B normales.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el control normal es una base de datos de control de diagnóstico desarrollada para cada enfermedad relacionada con RyR1.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho sujeto es un humano, cerdo, caballo, perro, gato o ratón. 35

9. Método según la reivindicación 8, donde dicho sujeto es un humano o un cerdo.

10. Uso de un equipo para la realización del método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el equipo comprende: (1) un agonista de RyR1 que es uno de 4-cloro-m-cresol, rianodina, halotano, tiopental o cafeína, (2) HClO4 y (3) 40 estándares para adenosina e inosina.

11. Uso del equipo según la reivindicación 10, donde el equipo comprende además un tubo de recogida de sangre heparinizado y un agente de aislamiento de linfocitos de sangre periférica.

12. Uso del equipo según la reivindicación 11, donde el equipo comprende además una etiqueta, opcionalmente con instrucciones.